2010环介导等温扩增法LAMP在水生动物病害检测中的应用.PDFVIP

一 71一 中国动物检疫 2010年第 27卷第 2期 环介导等温扩增法 (LAMP) 在水生动物病害检测中的应用 张家松 “。，王印庚 ，陈义平 。，张 健 ，雷霁霖 ，李卓佳 (1．中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛 266071； 2．中国水产科学研究院南海水产研究所，广东广州 510300； 3．中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；4．大连水产学院，辽宁大连 116023) 摘 要：近年来我国的水产养殖发展迅速，养殖面积和产量都位居世界第一。但是疾病频发一直是困扰水产养殖 的一个问题，而病原的快速检测是水产动物疾病防控的前提和关键。随着水产病害基础研究的不断深入，病原的检 测技术也得到快速发展。本文介绍了一种新型的核酸扩增技术——环介导等温扩增 (1oop-mediatedisothermal amplification，LAMP)，综述了近年来LAMP方法在水生动物病害检测领域的具体应用实例和研究进展，并对该方法 的应用前景做 了展望。 关键词：环介导等温扩增法(LAMP)；水生动物病害；检测 中图分类号：s94；$854．4 文献标识码：A 文章编号：1005—944X(2010)02—007l-03 核酸扩增是分子生物学中最常 e／tech／index1htm)。现在人们在不 反向外引物 B3同靶基因的B3C区段 用的方法之一，目前核酸扩增的方法 断对LAMP技术进行改进，已逐步应 完全互补。LAMP的引物设计规则与 很多，如聚合酶链反应 (PCR)、依赖核 用于疾病基因诊断、性别判定、食品 PCR相似，但是比传统的PCR复杂， 酸 序 列 扩 增 (nucleicacidse— 分析和环境监测等领域。 其引物设计主要遵循以下原则。 quence—basedamp1ification，NAS— 1 环介导等温扩增法技术介绍 1．2．1 引物 间的距离 F2与 B2之 BA)、自主序列复制 (self—sustained 1．1 环介导等温扩增法的原理 间的碱基数约为 120～180个；F2与 sequencereplication，3SR)以及链 针对靶基因的6个区域，设计 4 F3或者B2与B3间的碱基数为20个 置 换 技术 (strand displacement 条特异性引物，利用一种链置换Bst 以内；F2与Fl或者B2与B1之间碱 amplification，SDA)，这些方法都能 DNA聚合酶 ，在恒温 65℃左右反应 基数为40~60个。 将微量样本进行快速扩增，但都在特 lh。同一链上的一组引物顺序地退火 1．2．2 引物 的Tm值 一般情况下 异性、简便程度 、温度和试剂仪器要 到靶区域。BstDNA聚合酶有链置换 Tm值为 55~65℃。 求等方面有较高的要求。随着分子生 活性 ，在其作用下，后阶段退火的引 1．2．3 GC含量与二级结构 Gc含 物学技术的发展和对传统核酸扩增 物置换前面引物所形成的链。置换发 量约 50％~60％。尽量避免二级结构的 技术的改进，2000年 Notomi等 [fl发 生在两条链上，对引物设计的要求是 产生，尤其是3 端。此外还要注意 明了一种新的核酸扩增技术，即环 能形成环状结构。反应在恒温条件下 3 端不可出现富AT结构。 介 导 等 温 扩 增 (1oop—mediated 进行，链的变性是由链置换产生的。 1．2．4 引物末端 的稳定性 F1C与 isothermal amplification， LAMP反应形成一系列不同长度茎环 B1C的5 端，F2 ／B2、F3 ／B3的3 LA肝)。该技术的其特点是针对靶基 结构的DNAs，再通过特定的方法判断 端 6个碱基 的 dG值要小于 一4kal 因的6个区域设计4种特异引物，利 扩增与否。由于4条引物杂交到 目标 mol～。 用一种链置换DNA聚合酶 (BstDNA DNA的6个不同区域而使得反应高度 1．3 反应体系 polymerase)在恒温条件 (65℃左 特异。 标准的反应体系含有具链置换 右)保温几十分钟，即可完成核酸扩 1．2 引物设计