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真核细胞表达外源基因必须注意： 1. 真核细胞表达载体带有能在真核细胞中表达外源基因的真核转录调控元件。 2. 不同类型的细胞具有不同的特性,注意选择体细胞。 酵母：酿酒酵母、毕赤酵母 杆状病毒宿主：sf9、sf21 哺乳动物细胞：COS、CHO….. 表达方式 瞬时表达：无需筛选 稳定表达：整合染色体/抗药性，需筛选 表达产物的检测 基因转录产物： RT-PCR， Northern-blot 基因翻译产物： SDS/Western-blot, ELISA, RIA 真核细胞表达的发展趋势 体内表达 组织特异性表达 定位表达 定量表达 * 右下角图标有超级链接回到一 自然界的基因转移和重组 * 左下角图标有超级连接到二 重组DNA技术 * 切口、配伍末端处均有相应超级链接 * * * 基因组DNA文库、 cDNA文库旁图标处均有相应超级链接 左下角图标有超级链接到二 重组DNA技术 * 左下角图标有超级链接到目的基因的获取 助溶（减少包涵体形成） GST（Glutathione-S-Transferase）系统 Thioredoxin 系统 Chaperone系统 特殊用途: 表面展示技术 噬菌体展示技术（Phage DisplayTechniques） 丝状噬菌体展示系统 λ噬菌体展示系统 T4噬菌体展示系统 细菌展示系统细菌表面（Bacterial displayTechniques） 抗原表位的筛选 蛋白相互作用筛选 酶的底物和拮抗剂的筛选 受体的激活剂和拮抗剂的筛选 表达产物的鉴定 目的基因的正确性 测序，酶切，杂交，PCR 表达产物的鉴定 理化性质，生物学功能 大肠杆菌表达条件的优化 （大肠杆菌系统中，影响外源基因表达的因素） 组成： -10区（TATA box, pribnow box）-35区 类型： 1. Lac乳糖操纵子的启动子: IPTG 2．PL/P R噬菌体启动子: 42OC 3．trp启动子: ?-吲哚丙烯酸 4．tac启动子: IPTG（ Ptrp, -35; Plac , -10） 5. T7, T3, SP6: IPTG ①选择可调控的强启动子 ② 引入原核增强子样序列 DNA序列 转录起始点上游至少100bp 增强基因转录 ③优化影响RNA翻译效率的因素 SD ATG AGGAGGU ATG AAGGA ATG UAAGGAGG ATG SD 序列 （UAAGGAGG） ATG与SD距离 ATG与SD之间碱基种类（A/T） Arg密码子AGA,AGG,CGG,CGA, Ile密码子AUA, Leu密码子CUA, Gly密码子GGA 和Pro密码子CCC在E.coli中很少使用，当异源目的基因的mRNA在E.coli中表达时，tRNA的数量直接反映了mRNA的密码子偏倚性。一个或多个的稀有或缺少可能导致翻译的停止。成串或多个稀有密码子时，外源蛋白的表达将非常低，且产生不完全产物。 在宿主菌中增加稀有密码子tRNA，含有稀有密码子基因的蛋白产量大大提高 ④使用大肠杆菌优势密码子或共表达稀有密码子tRNA基因 ⑤增加mRNA的稳定性 5’ AAA 3’ Hairpin 5’ AAA 3’ Repetitive extragenic palindrome, REP 重复性基因外回文序列 ⑥提高表达产物的稳定性 ?分泌性表达：间周质/细菌外 ?与细菌固有蛋白进行融合表达 ?改造蛋白酶识别位点 ?使用蛋白酶基因缺陷细菌 ?共表达蛋白稳定辅助因子（HSP） 实例 TNFa表达载体的构建 TNFa工程菌的建立 表达和鉴定 样品的鉴定 酵母、昆虫、果蝇、哺乳类动物细胞 优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点： 操作技术难、费时、经济 真核表达体系 真核系统表达的意义/目的 1、研究蛋白功能 推导目的蛋白功能 构建表达载体 转染细胞 表达验证 细胞功能检测 2、研究蛋白功能域 确定蛋白功能域 构建点突变/ 缺失突变表达载体 转染细胞 表达验证 功能变化检测 3、大规模制备蛋白 生物活性产品：EPO、t-PA、GM-CSF 疫苗： rHBsAg 蛋白晶体结构分析 真核载体 ?酵母 　　　?杆状病毒 　　　　　　 ? 哺乳动物细胞 穿梭载体(shuttle vector): 能在不同宿主中复制和表达的载体。 原