[医药卫生]致病菌分子分型技术.ppt

致病菌分子分型技术在食源性疾病暴发识别与溯源调查中的应用 致病菌表型分型与分子分型的方法对比 为什么要做分子分型？ 重点介绍以下几种分子分型方法 16S rRNA基因测序分型 RFLP（核糖体分型 限制性片段长度多态性分型） PFGE（脉冲场凝胶电泳分型） MLST（多位点测序分型） （一） 16S rRNA基因测序 RNA mRNA tRNA rRNA mRNA/tRNA Ribosomal RNA 核糖体RNA 蛋白质和RNA两部分组成 原核生物核糖体（70S) 小亚基(30S) 大亚基(50S） 小亚基(30S) 16S rRNA(1542个核苷酸) 蛋白质(21种） 大亚基(50S） rRNA 5S， 120个核苷酸 23S，2940个核苷酸 蛋白质(31种） 分子标志－16S rRNA 存在于所有原核生物的细胞中，并执行相同的功能 保守区域几乎与所有种属的核糖体靶位点结合 异质性区域变异程度不能区分亲缘关系接近的细菌 具有分子计时器的特点，分子序列变化缓慢，能跨越整个生命进化过程 分子中含有进化速度不同的区域，可用于进化程度不同的生物之间的系统发育研究——进化树 （二） 限制片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP) 核糖体分型 利用染色体高度保守rRNA基因（rrn）区域的DNA多态性 使用大肠埃希氏菌的RNA作为通用探针 研究细菌的DNA限制性图谱，对细菌分类 RFLP Ribotyping 转移到膜上,与探针杂交，化学发光底物与特殊片断结合,用数码相机检测并捕捉片段的影像 专用软件对图谱进行分析 （三） 脉冲场电泳技术 （PFGE） PFGE 动物、肉类和人的多重耐药Newport沙门菌分离株的PFGE图谱 已开展PFGE的菌种 非伤寒沙门菌 伤寒与甲型副伤 空肠弯曲菌 单增李斯特菌 志贺菌 大肠杆菌O157 霍乱弧菌　　 　 　　　　　 （四）多位点序列测定（Multi-Locus Sequence Typing，MLST） 分型的基础：细菌基因组内位于同一位点的看家基因的片段是否存在变异 看家基因的测序 不同的等位基因指派一定的数值，生成等位基因谱 每个等位基因谱认定为一个序列型（ST） 进化树确定亲缘关系 MLST 可以用于暴发调查 种群生物学分析，特别适合于分离株有足够时间进行分化的全球流行病学（Global epidemiology）研究 eBURST 软件分析菌株之间的亲缘关系 MLST 数据分析 START软件 BURST软件 细菌性病原体的MLST 数据库 / 16S rRNA序列，但产生不同的RiboPrint模式 目前分子分型“金标准” 敏感、特异、重复性高、分辨率高 征对整条染色体分型 细菌的染色体 稀有酶切位点 限制性内切酶消化 电泳 费用：100元/菌株 + + + + + + + + - - - - - - - - Electric Field 1 Electric Field 2 Switch Time CHEF 脑膜炎奈瑟氏菌 布鲁氏菌 猪链球菌 链球菌 食源性 非食源性 菌株之间的相互关系和系统发生关系研究 病原菌检测鉴定 增菌培养 基因测序 序列分析 可靠序列 数据分析 结 果 结 论 看家基因扩增 MLST分型方法实验流程 5株均属于ST1克隆复合体 在溯源调查中的应用 3 5 现场 Lab PFGE应用 Ribotyping应用实例 2 在暴发识别中的应用 4 Lab 现场 快速 4000元/8株菌 耗时 100元/株菌 耗时 费用 易 难 操作难易 好 好 重复性 高 较高 区分力 88%，霍乱等3种菌不能分辨 100% 分辨率 Ribotyping PFGE