14- 第17章 流式细胞仪分析技术及应用.ppt

第十七章 流式细胞仪分析技术及应用 第四节 流式细胞术在免疫学检查中的应用 一、淋巴细胞及其亚群的分析 二、淋巴细胞功能分析 三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型 四、肿瘤耐药相关蛋白分析 五、AIDS病检测中的应用 六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析 七、移植免疫中的应用 流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。 流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统和信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成。在对细胞悬液中的单个细胞或其超微结构进行多参数快速自动分析过程中，每秒钟能测量数千个至数万个细胞，能在分析过程中按实验设计要求对特定细胞进行分析，带分选系统的流式细胞仪还可按实验设计要求分选出具相同特征的同类型细胞，用于培养或进一步研究。流式细胞技术所具有的分析和分选功能主要涉及光学原理、光电转换原理和测试原理三部分。 由样本和鞘液组成 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流。 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹在样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置保证检测的精确性，同时防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。 激光光源：气冷式氩离子激光器。激光束波长为488nm。 分色反光镜：反射较长波长的光，通过较短波长的光。 光束成形器：两十字交叉放置的透镜。将激光器发射的激光束聚焦成高15μm，宽57μm的椭圆光斑。 透镜组：将激光和荧光形成平行光，除去离散的室内光。 滤片：长通、短通、带通滤片三种，有525nmBP，575nmBP，620nmBP，675nmBP 4种。 光电倍增管：FS, SS（散射光），FL1, FL2, FL3, FL4（荧光），主要作用是检测荧光和散射光，同时将光学信号转换成电脉冲(数字数据)信号。 主要由计算机及其软件组成 基本工作原理 标记了特异性荧光染料的单细胞悬液和鞘液，分别经硅化管进入流动室，形成鞘液包裹细胞悬液的稳态单细胞液柱，该液柱以稳定的层流形式通过喷嘴的高速射下，液柱与水平方向高度聚焦的激光束垂直相交，单个细胞上标记的荧光染料在通过激光光斑时被激发而产生特异性荧光，同时，由于混合细胞群中细胞大小和胞内颗粒的多少会被激发而产生不同的散射光。在入射光束与液柱垂直的方向有荧光检测系统和散射光感受系统，用于收集荧光信号和侧向散射光信号，前向散射光感受器在前向小角探测接受前向光信号。被接收的光电信号被光电倍增管转换成电压脉冲和积分脉冲，该信号进入计算机系统进行数据转换、储存、分析、处理，采用相应软件程序对结果进行综合分析，并以图像和数据显示于荧光屏上。 前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号。用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS二维点图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。 此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤光片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。 采用荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长。 荧光染料的特性 (一)荧光信号测量与放大器 荧光信号的放大测定通常使用线性放大器和对数放大器。 线性放大器用于测量信号强度变化范围较少时的信号或代表生物学线性过程的信号。 对数放大器用于测量信号强度变化范围较大且较光谱信号较复杂的信号，在免疫测量中最常使用。 目前使用的流式细胞仪至少能用一个激光束检测三色甚至四色激发荧光信号。从而使仪器的检测特异性及精确性进一步提高。 最常用于单克隆抗体标记的三种荧光染料分别是FITC、PE(藻红蛋白)、ECD 或PeCy5，其均能在488nm激光下发出525、575、620nm或675nm的绿色、橙色、橙红色或红色荧光。 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。 参