激光扫描共聚焦显微镜技术及应用.ppt

HEK Cells-3D Volvox Z-Stack 拟南芥细胞：叶绿体，线粒体 Co-localization FITC+Sytox Green Zebrafesh Embryo Unknown  激光扫描共聚焦显微镜技术及应用 原理 2. 在生物医学中的应用 3. 样品要求 标本： 1.经荧光探针标记(单标、双标、三标） 2.固定的或活的组织 3.固定的或活的贴壁培养细胞应培养在 Confocal专用小培养皿或盖玻片上 4.悬浮细胞，涂片或滴片后，用盖玻片封片 样品制备要求 样品制备要求 载玻片、盖玻片：载玻片与盖玻片的厚度应尽可能薄，玻面光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。 封裱剂：常用缓冲甘油封固。需无自发荧光，无色透明。由于甘油的荧光亮度在pH为8.5～9.5时较亮，不易很快褪去，故常用甘油和0.5MpH为9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。 ?荧光探针的选择：? ? 实验标本要求经过荧光染色后，才能进行激光扫描共聚焦显微镜观察和分析。应根据实验的要求选择合适的荧光探针，探针的选择应具有高灵敏度和高度的特异性。观察多重荧光标记时。应注意荧光的发射带是否重叠。同时还应注意实验标本的自发荧光与所测荧光信号的区分。 样品制备要求 激光共聚焦开放 时间：周二全天，需提前3-5天预约 地点：医学院主楼二楼203室 联系电话：2057882联系人：曹薇薇 * * * * * * * * Kd值：为Ca2+解离常数，指示检测Ca2+浓度的范围: 0.1xKd-10xkd —和很多因素有关（pH、 Mg2+、温度、与蛋白的结合、等） 细胞内生理Ca2+浓度值：10-100nM 细胞内Ca2+超载浓度值：基础Ca2+浓度的10倍左右 * 激光扫描共聚焦显微镜技术及应用 The techniques and application of Confocal Laser Scanning Microscopy 新疆地方与民族高发病重点实验室 曹薇薇 原理 2. 在生物医学中的应用 3. 样品要求 激光扫描共聚焦显微镜技术及应用 激光共聚焦扫描显微镜基本配置 Laser and electronic Control Unit 激光光源及 控制装置 Computer 计算机 Microscope 荧光显微镜 Anti-vibration table 防震台 Confocal scan and detector unit 共聚焦扫描及检测装置 ZEISS LSM510 META Confocal System 激光共聚焦扫描显微镜基本原理 激光共聚焦扫描显微镜基本原理 普通光学显微镜和共聚焦显微镜的比较 增加的部件 扫描模块 电子控制器 激光模块 激光扫描共聚焦显微镜 普通广视野光学显微镜 图像采集 并行，一次一幅 串行，逐个像素的 照明区域 广视野 点照明 检 测 器 眼睛或CCD照相机 单通道光电倍增管 多色多通道光电倍增管 信号分离 分色镜，吸收滤光片 分色镜组，吸收滤光片 反射光栅（新） 非共聚焦 / 共聚焦图像 广视野 共聚焦 非共聚焦 / 共聚焦图像 激光共聚焦显微镜在同一时刻对样品中的一点成像 这一点的像在屏幕上显示为一个像素 为获得样品的二维图像，激发光的聚焦点必须在样品上移动 从点到二维图像 扫描镜驱动激发光束以线的方式移动 扫描过程中得到的像素构成最终的二维图像 聚焦光锥 样品 X/Y 图像 X Y 通过激发光的水平移动（X/Y），得到样品中某一特定层面的二维图像 这一层面代表了样品中的一个光学切片 无物理接触的采集 要获得样品的三维信息，激发光聚焦点不仅要在XY方向上移动，还要在Z方向上移动 通常，在扫描一个XY平面后，通过载物台的垂直移动使激发光聚焦点在Z方向上移动 结果是一个三维数据序列，包含着若干幅代表样品中不同光学切片的XY图像 X/Y/Z 序列 Z轴驱动 从点到三维图像 普通广视野荧光图像 样品的厚度大于物镜的焦深 扩展焦深 共聚焦显微镜获得的样品的光学切片 光学切片的厚度取决于共聚焦针孔的直径 一系列取自不同光学层面的的共聚焦图像，包含着整个样品的图像信息 扩展焦深 时间序列 时间序列记录（真实时间） 在线比率 内/外触发（4内4外） 荧光漂白程序 事件标记 像素时间 感兴趣区域/线