变性梯度凝胶电泳PCR.ppt

2011年9月X日 变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)最初是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变。Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究 。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）。此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。 变性梯度凝胶电泳（DGGE）: 一种分离相似大小DNA片段的电泳方法。即双链DNA在变性剂(如尿素或甲酰胺)浓度或温度梯度增高的凝胶中电泳，随变性剂浓度升高，由于Tm值不同，DNA的某些区域解链，降低其电泳泳动性，导致迁移率下降，从而达到分离不同片段的目的。 由于各类微生物（如细菌和古细菌）的16sRNA基因序列中可变区的碱基顺序有很大的差异，其中不同土壤微生物的16sRNA基因的V3区扩增的DNA片断在DGGE中的应用最为广泛，根据电泳条带的多寡和条带的位置可以初步辨别出样品中微生物的种类多少，粗略分析土壤样品中微生物的多样性。 环境样品基因组DNA的提取 目标片段的PCR扩增 DGGE图谱的分析 图像的采集和条带的回收 DGGE 分析 电泳前准备工作 电泳分析 剥胶、染色 DGGE条带测序 总DNA的提取是DGGE研究微生物群落的基础。适合的DNA提取方法对环境样品微生物群落结构分析非常重要。 适合DNA提取方法的考量：①DNA的得率。②能否进行PCR扩增以及扩增的重复性。③制备DNA花费时间的长短。 关于DNA提取的建议： 优先考虑基于原位裂解的方法，根据实际情况采用酶解/酚氯仿抽提法，或者DNA提取试剂盒（建议购买Qiagen公司相关产品） 。 选择适合的目标片段，设计合适的引物，注意有GC夹子情况下引物二聚体的行程。 环境样品目标片段的扩增最好采用Touch down PCR。 注意PCR的环境，V3区产物扩增极易污染。 细节决定成败！ 从这一步开始，带上手套。 配置试剂时一定要用去离子水，可以配置不同梯度的变性溶液备用，注意变形溶液中大颗粒的过滤及脱气。 制胶洗膜时用的各个容器要用去离子水洗涤干净，以防止氯离子污染。 灌胶前准备好所有需要的东西，试剂、枪头，甚至物品摆放的位置。 制胶是实验的关键，在往玻璃板中灌胶时要匀速地转动滑轮，将凝胶液匀速地灌入玻璃板。 灌胶后立刻清洗注射器，以防丙烯酰胺凝固，堵塞管子。 DGGE制胶主体部件： 上样的胶孔要用去离子水冲洗干净并吸干。 PAGE胶装入电泳支架时注意用去离子水润滑橡胶垫。装入后在胶孔中加入缓冲液。 上样时上样器要深入胶孔底部。 尽量在同一个胶上比较所有样品，每一个胶上要有marker lane。 将胶放入电泳槽中时注意正负极。 建议低电压电泳一段时间，在样品完全进入胶中之后再升电压。 停止电泳后注意把电泳仪调零之后在关闭电源 剥胶需要细致，用好去离子水和保鲜膜。 染色前做好胶样品顺序的标记。 银染、EB染色和SYBRGreen染色。 ——垂直电泳 获得高质量的DGGE图谱。 DGGE条带的回收 －－注意紫外条件下操作的安全。 －－尽量减少DNA在紫外下的照射时间。 －－不同长度目标片段从切胶条带中的回收。 测序注意要点 －－回收条带的DNA在PCR扩增后，一定要克隆 －－确认克隆与母条带可以跑到同一个位置后，再送去测序 －－每个条带至少测3个克隆 DGGE图谱的聚类分析、相似性分析 用Quantity One（Bio-Rad，USA）软件对DGGE图谱进行数字化处理。按照如下公式计算多样性指数（Shannon-Wiener index） 其中，s代表每泳道中的条带数量；Pi为泳道中第i条带灰度（height of the peak）占该泳道总灰度的比例。 菌群均匀度（evenness，E）：E=H′/H′max，H′max=ln S Quantity one的应用 问题和讨论