第四讲 测序.ppt

* DNA核苷酸序列分析 传统的DNA序列分析法： Sanger双脱氧链终止法和 Maxam-Gilbert化学分析法 新发展的DNA杂交测序法 Sanger双脱氧链终止法原理： 双脱氧链终止法要求使用一种单链的DNA模板和一种适当的DNA合成引物。 利用DNA聚合酶的两种酶催化反应的特性：第一，DNA聚合酶能够利用单链的DNA为模板，合成出准确的DNA互补链；第二，DNA聚合酶能够利用2’，3’-双脱氧核苷三磷酸作底物，使之掺入到寡核苷酸链的3’-末端，从而终止DNA链的延长。 Sanger双脱氧-M13体系 M13是噬菌体载体，可以得到单链的DNA序列。 Sanger双脱氧-pUC体系 pUC是一种质粒载体，利用双链质粒DNA模板的双脱氧DNA序列分析法。 Maxam-Gilbert化学分析法 1977年由美国大学A.M.Maxam和W.Gilbertf发明。 原理： 用化学试剂处理末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割。由此产生的一组具有不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳按大小分离和放射自显影之后，便可根据x光底片上所显示的相应谱带，直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。 由于这种化学切割反应的特异性是由碱基的修饰作用决定的，所以切割反应必定是定量的。 化学切割反应的试剂： 肼（hydrazine） 硫酸二甲酯（dimethylsulphate） 肼： 又叫联氨（NH2.NH2），在碱性条件下，与胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（ C ）作用。再通过六氢吡啶的作用，使两个磷酸分子从糖片段上释放出来，从而导致在核苷酸位置上发生DNA的断裂。 盐存在的条件下，联氨同胸腺嘧啶（T）的反应便会被抑制，最终只发生胞嘧啶碱基特异的切割反应。 由此来区别C和C+T这两种化学反应 *