酶学及酶工程课4章2节3节14.pptVIP

酶学及酶工程 Enzymology and Enzyme Engineering 第四章 酶的功能基团及抑制剂第二节 酶的必需基团数目的测定 解决什么问题 通过化学修饰确定了某酶分子中有什么必需基团之后，还经常需要了解必需基团的数目。 确定必需基团数目的基本方法是测定修饰过程中的基团修饰数目和相应的剩余活性，再计算和作图得到结果。 由于被修饰的既有必需基团，还可能有非必需基团，因此不能直接由基团修饰数目得到必需基团数。 邹氏作图法：修正早期的传统方法 由于作图不一定是直线，和被作用的基团不都是必需基团，这个方法并不准确。邹承鲁推导了一套公式和作图方法用于判定必需基团数，并获得验证，被称为邹氏作图法，现已得到广泛运用。该成果获得了国家自然科学奖。 第一种类型 事件：基团未被修饰。 核糖核酸酶中必需组氨酸数目测定 己烯酮酰化α－淀粉酶 实验：判定必需基团数目时 需定量测定的量 在修饰过程中基团被修饰的数目； 在修饰过程中的剩余活性； 以上两组数据需一一对应。 3 如有可能，测定可被修饰基团的总数目。 基团修饰数目测定方法 1. 测定修饰剂在酶上结合的数量：光吸收，荧光，放射性同位素等； 2. 修饰反应的作用物到产物有可定量测定的变化时，通过该项测定得到修饰剂作用的量； 3. 对于作用速度很快，很低浓度即可完全作用的试剂，通过定量加入，完全反应的方法，以加入量作为修饰量。 第三节 亲和标记判定及在研究中的的应用 一、亲和标记 (Affinity Labeling） 亲和标记，在邹氏理论中称为络合型不可逆抑制，是最有意义的一种化学修饰，这是因为它可以很专一性地作用于酶的活性部位。亲和标记是分步反应，修饰剂先可逆地结合在酶的活性部位，再不可逆地修饰该部位必需基团，而造成不可逆失活。亲和标记修饰剂一般是底物类似物，和底物含有共同的结合于酶的基团。亲和标记的作用符合饱和动力学特征。可以把亲和标记过程看做一次自杀性酶反应。 典型实例：TPCK专一作用胰凝乳蛋白酶 亲和标记的动力学特征 亲和标记作用过程： 一般化学修饰反应速度和修饰剂浓度成正比。但亲和标记反应速度：V = k [EI], 不和修饰剂浓度成正比，而是表现为饱和动力学特征，最大反应速度为全部酶成为复合物时的速度，即Vm= k [E0]。 按和推导米氏公式类似方法可得到： 式中Vm和V分别为[I]饱和和不饱和 时的失活速度。Ks为可逆结合步骤 的解离常数。 亲和标记反应速度方程（传统动力学） 由于 Vm = k[E0]， V = k [EI] = kobs[E0] ， 由上式可得到 : 式中k为修饰步骤的真实速度常数，kobs为测定的速度常数。此速度常数为一级速度常数。亲和标记反应不符合二级反应动力学，没有二级速度常数。 此式作图为双曲线，双倒数作图为直线。 对比酶反应动力学（米氏公式）。 实验判断 检测kobs和抑制剂浓度关系的动力学方法是最广泛易行的亲和标记实验判断方法。 实验设计： 选择若干修饰剂浓度，在可测定的条件下浓度差距越大越好。对每个浓度作失活过程实验，半对数作图得到速度常数测定值。以kobs对修饰剂浓度作图，为过原点直线的是简单二级反应，为双曲线（双倒数作图为直线）的是亲和标记。 对比邹氏理论的络合型抑制判断。 作图、计算 双倒数公式： 1/kobs = 1/k + Ks/k (1/[I]) 测定不同[I]下的kobs，以1/kobs对1/[I]作图为直线。 直线的Y轴截距为1/k ，由Y轴截距计算可得到修饰步骤速度常数k； 直线斜率为Ks/k，斜率/Y轴截距得到结合步骤的解离常数Ks。 对比米氏公式的作图和计算。 研究实例 抑制动力学表示EGCG和NADPH为竞争性关系，但没食子酸丙酯是非竞争性的 本次课结束 下次课再见！ Thank you！ 没食子酸丙酯也失活脂肪酸合酶，但属于简单二级反应，不是亲和标记，作用速度也较慢。 Wang and Tian，BBRC（2001）288：1200-1206 没食子酸丙酯(R= OH) 二化合物共同点是都是没食子酸酯，而无酯结构的单体儿茶素对酶没有化学修饰，可知没食子酸酯结构是此修饰的作用部位。进一步探测可得到是其羰基正碳被氨基亲核攻击，形成对酶酰基化。但没食子酸丙酯不具备类似底物的儿茶素结构，所以不表现亲和标记特征，修饰所需浓度也较高。EGCG修饰为亲和标记型表现其在酶上有特定结合部位。 * * 田维熙 教授 中国科学院大学 早期的作图法 邹承鲁 赵康源，生物物理学报（1989），5 (3): 318－323 公式 n为可作用基团总数，m为被作用基团数。使a1/i对x或对m作图为直线的i值为必需基团数。 第二种类型 公式