大肠杆菌检测SOP(MI).ppt

- PepsiCo Confidential - * 大肠菌群/大肠杆菌检测和确认培训 2010.Aug 内容 一，大 肠 菌 群 / 大肠杆菌特性介绍 二，测试用材料 1，仪器 2，培养基 三，检测步骤 1，MI培养基配置 2，抗菌素配置 3，倒平板 4，样品稀释 5，抽滤 6，培养 四，结果分析 1，紫外灯分析 2，划线培养 3，确定分析 指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌 需氧及兼性厌氧 在37℃能分解乳糖产酸产气 革兰氏阴性 无芽胞杆菌 该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等 一、大 肠 菌 群 / 大肠杆菌特性介绍 二、测试用材料 1. 仪器 1.1 35℃±1 ℃ 的培养箱。 1.2 无菌1ml和10ml的一次性移液管。 1.3 45℃±1 ℃的水浴箱 。 1.4 接种环 1.5 150 x 20mm 带盖试管 1.6 50 x 6mm 小倒管（发酵管） 1.7 试管架 1.8 记号笔 1.9 蒸汽高压灭菌锅 1.10 电子天平（精度0.1g，最大量程不低于1200g） 1.11 无菌容器，如whirlpak或无菌瓶子 1.12 直径为55mm无菌平板 1.13 真空泵 1.14 过滤器及其气管和抽滤瓶 1.15 滤杯和滤膜 1.16 防止液体吸入真空泵的滤器 二、测试用材料 2，培养基 MI 培养基 按产品说明配制培养基并灭菌。 使用前，溶化培养基。 在适当的温度下（~45 ℃ ）， 每1升培养基，加入5ml新鲜配制的1mg/ml磺吡苄头孢菌素溶液。 磺吡苄头孢菌素(Cefsulodin) 溶液配制： 1，0.02克 磺吡苄头孢菌素 + 20ml 蒸馏水 2，溶液用0.2um的过滤器过滤消毒 备注：若抗菌素为已经配置好的灭菌后产品，则直接使用，不需要上述步骤。 MI 培养基 磺吡苄头孢菌素 二、测试用材料 MI 培养基原理 利用特定的酶反应，检测水中的大肠菌群和E.coli 培养基中含有两种酶底物： MUGal （荧光） 和IBDG （颜色） 大肠菌群可以产生β半乳糖苷酶 和MUGal 反应， 生成一种化合物在长波紫外下（366nm）发出荧光； E.Coli 可以产生β-葡糖醛酸糖苷酶， 和IBDG 反应，生成蓝色化合物， 菌落为蓝色。 加入磺吡苄头孢菌素：抑制革兰氏阳性菌和一些非大肠菌群的革兰氏阴性菌的生长 三，检测步骤 1，MI培养基配制 a,打开MI培养基 b，称取一定重量 7.3g c，加入200ml去离子水后摇匀 d，瓶外贴指示带，并标识。 e, 121℃,15min 灭菌 d, 观察指示带是否变成黑色 f, 放入45-50 ℃的水浴锅中冷却保温,待用 三，检测步骤 2，抗菌素配制 磺吡苄头孢菌素 1，密封，避光保存抗菌素 2，打开包裹的铝箔 3，称取一定量的抗菌素 4，转移到干净的试管中 5，添加一定量的无菌水入试管中 6，摇匀 7，立即用铝箔包裹试管外壁，避光 三，检测步骤 2，抗菌素配制:溶液灭菌 1,将配制好的灭菌素转移到无菌间 2,用10ml针筒吸取溶液 3，准备好空的无菌试管 4，取下针头，套上0.22μm的滤膜 5，将抗菌素溶液过滤到无菌试管中 6，立即添加到灭菌后的培养基中待用 三，检测步骤 3，倒平板 将已经添加完灭菌素的培养基分别倒入培养皿中，约1/3至2/3高度,冷却。 气泡 培养基未完全覆盖 培养基碰到皿盖 如下平板不可使用： 三，检测步骤 4，样品稀释 A,取原液2ml B,加入到含200ml无菌水容量瓶中 c, 摇匀后，依次稀释，得到3个稀释梯度的溶液 工具： 三，检测步骤 5，抽滤 a, 连接抽滤系统 b，放上滤芯，滤膜和滤杯 c，将待测溶液分别倒入滤杯中越100ml d, 打开抽滤泵和阀门 e, 取下滤膜 f, 平移到凝固好的培养皿中 三，检测步骤 6，培养 培养皿倒置后，放入35±2℃培养箱24小时。 培养皿叠放不可超过4层。 所有检测完成后使用工具/材料，均需灭菌后丢弃，以防污染。 滤膜放置需全面接触培养基，不可有空隙存在。 四，结果分析 1, 紫外灯照反应 蓝色菌落记为E.coli， 366nm下发出荧光的为大肠菌群 可见光下（大肠杆菌）阳性对照 366nm 下 MI 培养结果 紫外灯 四，结果分析 2,划线培养 疑似菌落在营养琼脂平板上划线培养35 ± 2°C 培养24小时 挑取蓝色,紫外灯下发荧光的菌落 接种到营养琼脂平板上，化线分离 挑取培养后琼脂平板上的菌落做如下测试： 1，氧化酶反应 2，革兰氏染色 3，产酸产气测试 4，靛基质反应 培养24小时后 四，结果分析 2.1