肝癌细胞培养(总结版).docVIP

BEL7402/hepG2/HCCLM等肝癌细胞培养过程 器材 ： 液氮冷冻灌、 恒温培养箱、 电冰箱、高压灭菌锅、离心机、倒置显微镜、 超净工作台、一次性吸管若干个、带塞培养瓶（不定个）、 试管架、酒精灯、G6型号细菌过滤漏斗、无菌冻存管、液氮瓶。 试剂 ： RPMI l640培养液， 胎牛血清（生长因子）, 胰蛋白酶液，70%乙醇（消毒）,冻存培养液（培养液7ml，胎牛血清2ml，DMSO 1ml)，PBS缓冲液等。 器皿的消毒及准备： 清洗灭菌（浓硫酸、蒸馏水）： （1）浸泡（酸浸）:新使用或重复使用的玻璃器皿须经浓硫酸溶液浸泡过夜，水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质，并消除其弱碱性。操作过程需戴防护用具。 （2）刷洗:浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。刷洗后经行烘干。 （3）冲洗、烘干备用:浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次，将清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干净透明，无油烟，不能残留任何有害物质及化学药品等。 （5）包装灭菌:器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止消毒灭菌后再次遭受污染。 实验前准备工作: 操作者的皮肤、培养瓶的盖和外壁常用酒精消毒。用紫外线消毒实验室空气、工作台面和一些不能使用其他方法消毒的培养器皿。进无菌室前或做完实验后，均应开灯照射30min进行消毒。紫外线照射60min可以消灭空气中大部分细菌。 细胞复苏： 冻存细胞保存管保存在液氮中（-196℃），取出保存管后必须快速冷冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，致使细胞死亡。在冻存细胞的保存管中含有对细胞有毒害的成分DMSO,故在解冻应马上将其去除。在冷冻活化前应在无菌台上将细胞培养液配好，然后将保存管从液氮中取出，放于37℃的温水中快速使细胞解冻。解冻后悬液快速移入培养液中混匀，离心去掉上清液，再加入细胞培养液。 实验人员穿上无菌实验室操作服用酒精喷于手上消毒，然后就位用酒精棉球擦拭实验台 （1）准备一消毒过的离心管（5ml即可）。 （2）从液氮罐中取出冻存管，并迅速放入40℃水浴，不时摇动，使其急速融化，1-2min内完成。 （3）冻存管用70％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液转移入上述离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来）。 （4）低速离心(1500r／min) 5min，去上清后加培养液（RPMI-1640），制成单个细胞悬液（可用滴管轻柔吹打）。 （6）将离心管中的混合液转移到培养瓶中，盖上瓶盖，标好细胞种类和日期、培养人姓名等，将培养瓶平放，置于37°C培养箱中培养。2-3天换一次培养基。 细胞传代： 当观察到培养瓶中细胞铺满度为90%时（细胞生长处于对数期时），解冻复活成功后的细胞要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶中培养的过程称之为传代培养。传代细胞细胞株的最大利处在于提供了大量持久的实验材料，便于实验。 （1）试验台的消毒工作准备好，弃去旧培养液，用PBS液（不含钙，镁离子）洗1-2次，以免剩余培养液影响胰蛋白酶活性。（细胞贴壁生长）。 （2）向瓶内加入1ml胰酶，置于37℃培养箱内进行消化，1--3min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化（直接加培养液）。 （3）将离心管放入离心管中，离心(1500r／min) 5min。 （4）将离心后离心管中液体倒掉，在离心管中加入3ml培养液，并反复吹打细胞，制成细胞悬液。 （5）取3个无菌培养瓶，酒精棉球擦拭消毒，并在酒精灯下过火消毒。 （6）将细胞悬液分装到培养瓶中，一传二或三。 （7）细胞培养换液时间应根据细胞生长的状态和实验要求来确定。一般2～3d后应换一次生长液。待细胞铺满器皿底面，即可使用；也可继续传代扩大培养或换成维持液。 细胞冻存： 细胞的冻存最常用的方法是液氮冷冻保存法，主要是加入适量的保护剂缓慢的冷冻细胞。细胞冻存在-196℃液氮中，储存时间几乎是无限的。细胞冻存及复苏的原则是慢冻快融。 （1）选对数增生期细胞(细胞铺满度为90%左右时)，在冻存前1d换液。 （2）按传代方法配制单个细胞悬液。 （3）再以1500r／min的速度离心5min，去掉上清液。再加配制好的冻存培养液（培养液7ml，10%胎牛血清2ml，10%DMSO 1ml），用吸管轻轻吹打