人可溶性血管内皮生长因子受体1抑制白血病细胞增殖的研究推荐.doc

人可溶性血管内皮生长因子受体1抑制白血病细胞增殖的研究 人可溶性血管内皮生长因子受体1抑制白血病细胞增殖的研究 【摘要】 本研究通过体外实验探讨人可溶性血管内皮生长因子受体1（sFLT1）对白血病细胞增殖的抑制作用。用RTPCR检测白血病细胞株K56 2、HL60、U937和骨髓LTCIC VEGF mRNA、VEGFR1（FLT1） mRNA的表达，用流式细胞术检测上述细胞VEGF和VEGFR1on the proliferation of leukemic cells in vitro. Reverse transcriptionpolymerase chain reaction as used to detect the VEGF mRNA and VEGFR1（FLT1） mRNA in K562, HL60, U937 leukemic cell lines and bone marro LTCIC. Flo cytometry as used to detect the VEGF and VEGFR1（FLT1）in all abovementioned cells. VEGF concentrations in the cell culture supernatants ere determined by enzymelinked immunosorbent assay 取健康成年人抗凝骨髓5 ml，按常规分离骨髓单个核细胞，以含12。5%胎牛血清、12.5%马血清的IMDM 4 ml重悬细胞，建立Dexter培养体系，每周半量换液2次。 VEGF和FLT1的检测 VEGF mRNA和FLT1 mRNA的RTPCR法检测 首先在NCBIGenBank中查到VEGF mRNA及FLT1 mRNA序列,根据文献确定目的基因的克隆范围,经计算机软件分析后设计引物。VEGF上游引物5′ACCATGAACTTTCTGCTGTC3′；下游引物5′TCACCGCCTCGGCTTGTCAC3′，扩增产物为651 bp；FLT1上游引物5′AGGGTACCCTCACCATGGTCAGCTACTG3′；下游引物5′CCCTCGAATTAGTGCCAGAACCACCTG3′ ，扩增产物为1 407 bp。VEGF引物由北京鼎国公司合成，FLT1引物由北京赛百盛公司合成。取生长状态良好的K56 2、U937、HL60细胞株和骨髓LTCIC各2×106细胞用TRIZOL一步法提取细胞总RNA，加适量DEPC水溶解，2%琼指糖电泳鉴定其纯度，并观察其是否降解，用DNA/RNA紫外分光光度计测定其含量。操作按AMVRT逆转录酶说明书进行，取5 μl RNA溶于12 μl DEPC水中，加入OligodT3 μl，70℃反应5分钟后置冰中冷却5分钟,再加入AMV 5×buffer 8 μl， 10 mmol/L的dNTPs 3 μl，RNasin 2 μl，AMVRT 2 μl，DEPC水补足50 μl体积，42℃反应90分钟，95℃灭活，得cDNA，-20℃冻存备用。VEGF和Flt1基因的PCR体系包括: Taq酶10×buffer 5 μl，10 mmol /L dNTPs 3 μl，VEGF或FLT1基因上、下游引物各1 μl，Taq酶0.5 U, cDNA 5 μl，灭菌水补足50 μl体积。置PCR扩增仪上扩增。VEGF的PCR条件为94℃预变性5分钟,然后变性、退火、延伸分别为94℃变性60秒,55℃退火90秒,72℃延伸60秒,循环30次后,72℃延伸10分钟。FLT1的PCR条件为: 94℃预变性5分钟,然后94℃变性60秒,56℃退火90秒,72℃延伸90秒,循环35次后,72℃延伸10分钟。所得PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳,以βactin作为内参照，共同用凝胶成像系统进行分析。 VEGF和FLT1的流式细胞仪检测 分别取K56 2、U937、HL60细胞和骨髓LTCIC各5×105，按VEGF及FLT1单克隆抗体说明书处理细胞，流式细胞仪检测各种细胞VEGF及FLT1的表达。 细胞培养上清VEGF含量的ELISA法检测 分别以104/ml，105/ml，106/ml接种K56 2、U937、HL60细胞和骨髓LTCIC于6孔板中，培养体系成分同前，培养72小时后留取细胞培养上清按VEGF ELISA试剂盒说明书定量检测细胞培养上清中VEGF的含量。 sFlt1对细胞生长的抑制作用 按5×105/（ell·150 μl)接种K56 2、HL60细胞和骨髓LTCIC于96孔板，于37