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第四章 外植体的选择和消毒 一、外植体的选择 二、外植体的消毒 一、外植体的选择 1.选择什么种类的植物 2.选择植物体的部位、发育年龄和季节 如：茎尖、茎段、块茎、鳞茎、球茎、表皮、皮层、维管束、髓细胞、树木的形成层，子叶、上胚轴、下胚轴、叶片、叶柄、叶枕和根，以及生殖器官中的花托、花瓣、花药、花粉、子房、胚珠、胚、胚乳、胚柄等都可以作为外植物体 由于不同植物以及同一株植物在不同发育阶段和时期所取的同一组织和器官在组织培养过程中,其脱分化和再分化的难易程度不同.所以取外植物体时应考虑以下三个方面: 1.取材的部位; 2.取材的季节 3.器官发育年龄的选择;4.取材大小的影响 (1)茎尖 是最普遍采用的部位，其分生能力强、生长速度快，且不带病毒，是获得脱毒苗的重要途径. 规律：一般顶芽生长势比侧芽旺，比较容易成活. 1.常见取材的部位 (2)叶片 规律：老叶和幼嫩的小叶比成熟叶片难于培养. 幼嫩的小叶生理功能还不健全，分化能力差；老叶生理功能已经衰退，叶柄营养成分减少，难以分化. 成熟叶片营养丰富，生理功能旺盛，光和作用能力强，细胞处于活性状态，容易脱分化和再分化 1.常见取材的部位 (3)茎 如：大花萱草等植物的侧芽在土中，极易污染，而且分化能力很差，用花茎做外植体时效果很好，细胞脱分化和再分化都很快. 1.常见取材的部位 (4)鳞茎 百合、大蒜等植物做外植物体时效果较其它部位好，且鳞茎的不同部位的再生能力有很大的差别，外层比内层鳞片叶的再生能力强，同一鳞片下段比中上段再生能力强. 1.常见取材的部位 因此，选择合适最能表达全能性的部位和组织，是决定组织培养成功的前提之一. 2.取材季节的选择 规律：一般植物在旺盛生长期取材比较好，而在即将进入休眠期和休眠期的外植体的效果较差. 如：苹果在3-6月份取材成活率为60%，7-11月份就下降到10%，12月至次年2月份则在10%以下. 马铃薯在4月份和12月份取的茎做外植体有较高的块茎发生率，而在2-3月份或5-11月份取的则块茎发生率大大降低. 百合的鳞片做外植物体时，在春、秋取材容易形成小鳞茎，而在夏、冬取材就难以形成小鳞茎 在杂交育种过程中遇到杂种胚发育不良、早衰等现象，要在胚早衰之前取出并进行培养，一般都是在胚接近七八分成熟时而不是完全成熟时进行胚培养. 杂种胚，特别是远缘杂交的胚，后期败育，一切生理活动都停止了，必须在败育之前进行培养. 3.取材大小的影响 要求：大小适宜，大的不易消毒，小的操作困难且不易成活. 如：脱毒培养时要求茎尖大小为0.2-0.3mm；叶片做外植体时，不能小于5mm2 3.取材大小的影响 除叶片外，花瓣、茎段等也都不宜取得太小，但也不能过大。过大则难以消毒灭菌，容易引起污染等. 二、外植体的消毒 （一）外植体消毒灭菌的要求 包括两个方面： 把外植体上带的一切微生物，包括真菌、细菌及其他微生物都杀死 不能损伤组织材料，保持外植体的生活力，使外植体在良好的培养条件下很快恢复生机，正常生长和繁殖. （二）常用消毒剂的种类和特性 要求：具有良好的消毒作用，既不会杀死植物的组织细胞，又易被无菌水冲洗掉，不影响消毒后外植体的生长和分化. 常用消毒剂效果比较 各种消毒剂的特性 70%-75%的酒精 特点:具有很强的穿透力和杀菌力,通常外植体浸入15-30秒种即可起到消毒作用.由于酒精对组织细胞的杀伤力比较强,使用时间不能过长,一般达不到彻底消毒的要求，但酒精的浸润作用可以促进其它消毒剂渗透到外植体的整个表面，提高杀菌效果常做为消毒的第一步. 各种消毒剂的特性 次氯酸钠（NaClO） 可以分解释放Cl2,具有较强的杀菌作用,对植物细胞的损伤较小,消毒时间10分钟左右为宜. NaClO+H2O+CO2 NaHCO3+ Cl2 注意:须防潮解,要求密封储存,使用时随配随用 各种消毒剂的特性 氯化汞(HgCl2) 原理:具有剧毒的重金属盐杀菌剂,其Hg2+可与带负电荷的蛋白质结合,使微生物菌体蛋白变性而失活. 缺点:对植物组织的损伤较大,且不易被无菌水洗去,对人体也有毒害作用. 优点:消毒效果好,且稳定,能长期保存 小窍门:在HgCl2溶液中加入一滴1mol/L的盐酸,灭菌效果更好 各种消毒剂的特性 H2O2 原理:强氧化剂,可杀死微生物. 优点:容易被无菌水洗去 使用浓度为:10%-12%,消毒时间为5-15分 外植体消毒的一般程序 70%酒精 外植体放入 灭菌的小烧杯(三角瓶等)中 15-30秒