CN107354124-CN201610305801-一种铁皮石斛细胞规模培养方法.pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 107354124 A (43)申请公布日 2017.11.17 (21)申请号 201610305801.8 (22)申请日 2016.05.10 (71)申请人 苏州天成新农生物科技有限公司 地址 215126 江苏省苏州市苏州工业园区 兴浦路333号现代工业坊5号厂房4层C 区 (72)发明人 张杰　 (74)专利代理机构 南京艾普利德知识产权代理 事务所( 特殊普通合伙 ) 32297 代理人 陆明耀 (51)Int.Cl. C12N 5/04(2006.01) C12N 5/02(2006.01) 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 (54)发明名称 一种铁皮石斛细胞规模培养方法 (57)摘要 本发明公开了一种体外规模化悬浮培养扩 增铁皮石斛细胞的工艺，其培养过程是：铁皮石 斛带休眠芽茎段，插入到适宜固体培养基上，待 愈伤组织长出后或胚状体诱导出后，置于相同的 上述培养基上扩增，扩增后将愈伤组织/胚状体 进行匀浆酶解、研磨或喷雾等理化手段分解为单 细胞悬液，置于摇床上震荡悬浮培养，经数次继 代适应悬浮培养后，转入大规模生物反应器中进 行连续扩增，待达到生长密度后，通过调节生物 反应器中的指标，达到每25-60天收获一次，或者 连续、半连续收获，多糖含量达到20％以上，并保 持常年稳定扩增的从20L-吨级单元的大规模铁 A 皮石斛细胞悬浮培养连续扩增体系。 4 2 1 4 5 3 7 0 1 N C CN 107354124 A 权　利　要　求　书 1/1 页 1.一种体外规模化悬浮培养扩增石斛细胞的方法，其培养过程是：将石斛愈伤组织使 用常规方法进行扩增培养，得到扩增后的愈伤组织或胚状体，将愈伤组织或胚状体组织进 行匀浆酶解、研磨或喷雾等理化手段分解为单细胞悬液，将细胞种子按一定接种比例接种 到生物反应器中，通过调节氧含量在30-50％之间，pH为5-7，固定光源光照10-20h，光照强 度2000-8000Lx，培养分阶段进行，每一阶段为10-25天，不同阶段的光质交替变换，所述的 光质为红蓝光，所述的交替变换为红蓝光比例由第一阶段的2-3:4-5调整为第二阶段的3- 4:4-6，再由第二阶段的3-4:4-6调整为第三阶段的2-3:4-5，并以此模式循环；每阶段更换 新鲜液体培养基一次。每15-25天收获石斛细胞系培养物的30-50％，并补充相应比例的新 鲜液体培养基，培养持续进行；所述液体培养基为基本培养基中添加植物生长调节剂，植物 生长调节剂为生长素、细胞分裂素的组合或生长素、细胞分裂素与ABA的组合，生长素与细 胞分裂素比例控制在3:1，总浓度在0.05-5mg/L调整。 2.根据权利要求1所述的方法，所述基本培养基为MS、1/2MS、1/4MS、B5、N6、NLN、White 或SH培养基。 3.根据权利要求1所述的方法，所述的液体培养基与更换的新鲜液体培养基中的植物 生长调节剂相同，均为IAA/NAA/IBA 0.05-3mg/L:6-BA/KT/ZT0.05-3mg/L，总浓度为0.05- 5mg/L。 4.根据权利要求1所述的方法，优选的，更换的新鲜液体培养基中植物生长调节剂为 IAA/NAA/IBA 0.05-3mg/L:KT 0.05-3mg/L:ABA 0.05-50ug/L，总浓度为0.05-5mg/L。 5.一种提高石斛细胞系产量的体外规模化悬浮培养扩增石斛细胞系方法，其特征在