病毒滴度的测定 空斑形成单位法测定病毒滴度.ppt

病毒滴度的测定 小结 主要介绍空斑形成单位法、50%终点法、血凝试验和干扰滴定法测定病毒滴度的原理及其方法； 重点要掌握空斑形成单位法、50%终点法测定病毒滴度的原理及其滴度的计算； 熟悉：空斑形成单位法、50%终点法、血凝试验和干扰滴定法测定病毒滴度的具体方法； * 原理(重点)：适当稀释的病毒悬液与长成单层的宿主细胞混合，在细胞上覆以营养琼脂培养基等固体或半固体介质，由于琼脂的限制，病毒只能感染并破坏临近的细胞，造成细胞溶解而形成空斑，每个空斑由一个病毒颗粒造成，计算空斑数量再乘以稀释倍数即可得知原来的病毒感染单位的浓度。 空斑形成单位法测定病毒滴度 空斑形成单位（Plaque Forming Units, PFUs) 空斑显现原理(掌握)：空斑形成后，经中性红活细胞染色，活细胞显示红色，而空斑区细胞不着色，形成不染色区域。 空斑形成单位法测定病毒滴度 Procedures 适用条件(熟悉)：凡是能在细胞中产生细胞病变效应(CPE)的病毒都可以采用空斑形成法测定病毒滴度。 空斑形成单位法测定病毒滴度 中性红 (掌握) (熟悉) (了解) (了解) 空斑形成单位试验技术举例 p51-52 防止琼脂凝固； Hanks液？ 双抗？ 5% CO2 空斑形成单位的计算 (重点) (掌握) (熟悉) CCID50 ID50 LD50 (重点) (熟悉) 5% CO2培养箱 (熟悉) CCID50 TCID50 (熟悉) 病毒液 CPE孔数 无CPE 累 计 出现CPE孔 稀释度 孔数 CPE孔数 无CPE孔数 所占的% 10-1 8 0 27 0 100（27/27） 10 -2 8 0 19 0 100（19/19） 10 -3 7 1 11 1 91.6 （11/12） 10 -4 3 5 4 6 40（4/10） 10 -5 1 7 1 13 0.7（1/14） 10 -6 0 8 0 21 0（0/21）? Reed-Muench法计算CCID50 CPE(阳性)孔累计数由下向上累积 无CPE(阴性)孔累计数由上向下累积 (难点、重点) CCID50 (难点、重点) Calculation of TCID50 Use of Reed & Muench method (if 50 ul of virus dilution is added to each well) Karber法计算CCID50 病毒液稀释度 出现CPE孔的比率 10-1 8/8=1 10-2 8/8=1 10-3 7/8=0.875 10-4 3/8=0.375 10-5 1/8=0.125 10-6 0/8=0 (难点、重点) lgCCID50=L+d(s-0.5) L: 病毒的最低稀释倍数的对数 L=lg10-1 = -1 d：稀释系数，即组距 d=lg