(精编)【医学教学课件大全】 体液蛋白质检验教学课件.pptVIP

第二节 体液蛋白质检测 蛋白质的测定一般基于以下四种蛋白质的性质： 重复的肽链结构 酪氨酸和色氨酸残基对酚试剂紫外光吸收 与色素的结合能力 沉淀后借助浊度或光折射测定 一 血清总蛋白质测定 1凯氏定氧法—参考标准方法 结果较准确，是蛋白质测定的参考方法，但操作复杂，影响因素较多，不适用于日常工作，多用于标准蛋白的标定及校正其它的常规方法。 1.凯氏定氮法－参考标准方法(0.05mg N 0.3g pro) 消化　用浓硫酸将蛋白质消化为硫酸铵；（耗时） 蒸馏　用碱性溶液碱化消化液并蒸馏挥发； 吸收　用酸性溶液（硼酸）吸收气态氨（使[H+] ） 滴定　用已标定的无机酸滴（使[H+] 恢复），计算总氮量 定蛋白（总氮量-非蛋白氮）×6.25=蛋白含量 纳氏试剂：碘化汞和碘化钾的碱性溶液与氨反应生成淡黄棕色胶态化合物，其色度与氨氮含 量成正比。 原理： 2双缩脲比色法—血浆总蛋白测定推荐方法 蛋白质中的肽键（-CONH-）在碱性条件下与Cu2+络合成紫红色化合物，产生的颜色在一定范围内与蛋白质含量成正比。此反应和二分子尿素缩合后的产物双缩脲（ H2N-CO-NH-CO-NH2）与碱性铜溶液作用形成紫红色化合物的反应相似，故称为双缩脲反应。 此方法简便、准确、重复性好，但灵敏度较其它方法稍差，是目前临床上最常规的方法。 2.双缩脲法 原理： 蛋白质中的肽键（-CONH-）在碱性溶液中能与Cu2+作用而产生紫红色络合物， 其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。 条件：至少含两个肽键（-CONH-）基团才能和Cu2+形成络合物,氨基酸及二肽无反 应,三肽以上才能反应。 双缩脲生成 加热 ＋NH3 2 2 H－ 1800 2 2 2 2 2 N 端 C 端 3.酚试剂法 原理： 蛋白质分子中的酪氨酸残基和色氨酸残基能够和酚试剂中的磷钨酸-磷钼酸反应生成蓝色化合物， Lowry改良法：在酚试剂中加入Cu2+（75%呈色），提高了呈色的灵敏度，为双缩脲法的100倍左右。 评价及应用： 优点：操作简单，改良法灵敏度高（10μg-60μg），适合测定蛋白含量少的标本。 缺点：各种蛋白质酪氨酸和色氨酸比例不同，只适合测定单一蛋白质。受一些药物干扰。 4.紫外分光光度法 蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸可使蛋白质溶液在280nm处有一吸收峰。可用于测定蛋白质但需避免核酸干扰。 （1）Lowry-Kalcker 公式 蛋白质浓度（mg/ml）=1.45 A 280 - 0.74 A 260 （2）Warburg-Christian 公式 蛋白质浓度（mg/ml）=1.55 A 280 - 0.76 A 260 原理： 评价及应用： 优点：敏感而简便，可保留蛋白生物活性，常用与较纯的酶和免疫球蛋白。需紫外分光光度计及石英比色皿。 缺点：各种蛋白质中芳香族氨基酸含量和比例不同；在280nm测定易受游离色aa和酪aa以及尿酸和胆红素的干扰；导致准确性和特异性受影响。 措施：在220-225nm波长区域，用0.15mol/l的NaCl稀释1000-2000倍可消除干扰。 5.染料结合法 在酸性环境下，带正电的蛋白质（-NH3+)与染料的阴离子产生颜色反应，使染料的吸收峰改变，可既而用分光光度法比色测定。 原理： 常用染料：氨基黑，考马斯亮蓝等 评价及应用： 优点：操作简便，重复性好，灵敏度高，且干扰因素少。 缺点：特异性不高；不同蛋白质和染料的结合力不一致，标准物不易确定。 6.比浊法 原理： 评价及应用： 优点：简便不需特殊仪器。 缺点：浊度形成的干扰因素多（加试剂方法，反应温度，蛋白絮状沉淀等） 某些酸类（磺基水杨酸等）和血清蛋白质结合产生沉淀，测其浊度，与标准对比，可求蛋白含量。 参考范围：成人60－80g/L 临床意义： 总蛋白升高： 总蛋白降低：①丢失过多 ②消耗增加 ③白蛋白合成减少 ④水肿 真性升高：MM、巨球蛋白血症、自身免疫性疾病等 假性升高：机体明显失水，总蛋白含量相对升高， A/G几乎不变 7.折光测定法 溶解在溶液中的固体可增加溶液的光折射率，在固定波长和温度下，光折射率和血清中蛋白质含量成正比。 原理： 评价及应用： 优点：简便、快速，易掌握，重复性较好，适合临床急诊，体检