C_03细菌革兰氏染色法幻灯片.pptVIP

College of Life Sciences, Hubei Normal University College of Life Sciences, Hubei Normal University College of Life Sciences, Hubei Normal University Central Laboratory of Biology Central Laboratory of Biology 微生物学实验 食品微生物学实验 细菌的革兰氏染色法 课前预习与目的要求 【课前预习】 1.油镜的特点及使用范围是什么？ 2.革兰氏染色的原理是什么？ 【目的要求】 1.学习并掌握油镜的原理和使用方法； 2.了解革兰氏染色原理； 3.学习并掌握革兰氏染色的方法。 油镜提高分辨率基本原理 油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间是隔一层油质。如香柏油的折射率n=1.52，与玻璃相同。 光线通过不减低视野的照明度； 主要能增加数值孔径，提高显微镜的放大效能。 分辨率=λ/2NA λ=光波波长 （物镜的数值孔径值）NA=n×sinα α=镜口角的半数 可知n（介质折射率）对提高显微镜的分辩力起着关键性的作用。 革兰氏染色基本原理 细胞壁的成分和结构不同而造成的。 草酸铵结晶紫初染成蓝紫色，碘液媒染形成碘-结晶紫复合物，增强了染料在菌体中的滞留能力，两种细菌的脱色效果不同，蕃红复染。 革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低，肽聚糖本身并不结合染料，但其所具有的网孔结构可以滞留碘-结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。 而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，交联度低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加，原先滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变为无色，用复染剂（如番红）染色后又变为复染剂颜色（红）。 细胞壁结构图 实验用品 菌种：大肠杆菌24 h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，枯草芽孢杆菌12 h～18 h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。 试剂：革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈氏（Lugol）碘液，95%乙醇，番红复染液等。 仪器和其他用品：酒精灯，载玻片，显微镜，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，试管架，镊子，载玻片夹子，载玻片支架，滤纸，滴管和无菌生理盐水等。 方法步骤 A. 初染　 B. 水洗　 C. 媒染　 D. 水洗　 E. 脱色　 F. 水洗　 G. 复染　 H. 水洗　 I. 吸干 获得本实验成功的关键 选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。 涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。 脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。 注意事项 涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。 加热时使用载玻片夹子及试管夹，以免烫伤。 颜色判断以分散开的细菌颜色为准。 使用染料时注意避免沾到衣物上。 使用乙醇脱色时勿靠近火焰。 实验后洗手。 实验结果 分别绘制菌体形态图，并描述其特征。 填表 菌名 菌体颜色 细菌形态 结果（G+,G-） 思考题 现有一株未知杆菌，个体明显大于大肠杆菌，请你鉴定该菌是革兰氏阳性还是革兰氏阴性，如何确定你染色结果的正确性？ 为什么用老龄菌进行革兰氏染色会造成假阴性？ 生物学实验教学中心 College of Life Sciences, Hubei Normal University College of Life Sciences, Hubei Normal University College of Life Sciences, Hubei Normal University Central Laboratory of Biology