豆粕脲酶活性相关资料.ppt

大豆中脲酶活性测定 为什么要测定脲酶？ 脲酶毒性 一般脲酶并没有毒性作用，但在一定温度和pH值条件下，生大豆的脲酶遇水迅速将含氮化合物分解成氨，引起氨中毒。 大豆中的抗营养因子：胰蛋白酶抑制剂最重要 评估胰蛋白酶抑制剂活性 大豆饼粕中胰蛋白酶抑制剂抑制动物的生长和引起胰腺肥大。而直接测定大豆饼粕中的胰蛋白酶抑制剂的活性比较困难、耗时。脲酶和胰蛋白酶抑制剂在加热时有相近的速率变性，并且脲酶对热的抵抗力比胰蛋白酶抑制剂强，又易于测定，所以常用脲酶活性指标来判断大豆饼粕加热的程度和估计大豆饼粕中胰蛋白酶抑制剂是否已经被破坏。 脲酶活性测定的局限性 局限性 尿酶活性没有负值，它对任何过熟豆粕的最低值为零；对于加热过度的豆粕尿酶测定值不是一个可靠的指标 。 解决办法： 利用蛋白质溶解度去评价。原理是：加热使游离氨基酸与其它化合物的基团形成不能为消化酶所打开的分子间和分子内的结合键，因而降低了蛋白质的溶解度 。一般要求蛋白质溶解度（0.2%KOH溶液）应在70%～85%之间。PS＞85%时，表示加热不足，PS＜70%时则表示加热过度 生产实践中人们常将脲酶活性和蛋白质溶解度结合起来评价大豆饼粕的品质，用脲酶活性反映大豆饼粕是否过生，用蛋白质溶解度反映大豆饼粕是否受热过度。 适宜的脲酶活性值 大多数美国的测定表明：为破坏抗营养物质尿酶值应在0.20或以下。美国饲料工业协会建议的尿酶值为0.05-0.20。反刍家畜的日粮中往往加有尿素，因而过高的尿酶值有可能导致氨中毒。因此，在美国，反刍动物饲养者对豆粕尿酶值的要求是≤0.20。在欧洲则认为0.5是可接受的尿酶值（Deschrifver，1977）。我国《饲料用大豆》标准（GB10384-89）规定：“饲料用大豆需加热后使用，尿素酶活性不得超过0.4”。台湾省标准为0.02～0.3△pH 。 脲酶的测定方法 比色法 滴定法 PH增值法 快速检测法 比色法 实验原理 向含有EDTA二钠盐的PH=7的缓冲液的分析悬浮液中加入尿酸溶液，在30℃下保温5min，加入磷钨酸终止酶作用并沉淀蛋白质。产生的氨在次溴酸钠和麝香草酚作用下形成蓝色的靛麝香草酚，借以比色。 PH增值法 原理 用样品溶液PH值与试剂空白的PH值差计算尿素酶的活性。 仪器与器皿 PH计、恒温水浴、比色管 试剂 磷酸缓冲液：取3.403g磷酸二氢钾溶于100ml水中，取4.335g磷酸氢二钾溶于100ml水中，合并上述两种溶液并配制成1000ml，用酸溶液或碱溶液调至PH＝7。 尿素缓冲液：取15g尿素，溶于500ml磷酸缓冲液中，调解pH＝7。为了防止霉菌滋生，可以加入5ml甲苯作为防腐剂。 PH增值法（续） 操作方法 准确称取0.400g样品2份，分别置于两支比色管中，一只比色管中加入20ml磷酸缓冲液，作为空白试验（A管），另一只比色管中加入20ml尿素缓冲液（B管）。盖塞混匀，在30℃恒温水浴中准确保持30min。在此期间，每隔5min摇匀一次。取出后立即加入饱和氯化汞溶液2～3滴，在冷水中冷却，5min内测定溶液的PH值。 计算 溶液PH值（A）与试剂空白pH（B）值差为尿素酶活性，计算如下： 尿素酶活性＝B－A PH增值法（续） 注意事项： 应提前一天浸泡电极，保持电极清洁。 有时样品中的可溶性物质附着在电极上，可以降低测定准确度，操作时要快速果断。 滴定法 原理 将粉碎的大豆与中性尿素缓冲液混合，在30±0.5℃保持30min，尿素酶催化尿素水解产生氨，用过量盐酸中和氨，再用氢氧化钠标准溶液回滴。酶的活性用1g分析材料在30±0.5℃下1分钟产生的氨态氮的毫克数来表示。 滴定法（续） 仪器与器皿 pH计 恒温水浴 比色管 10ml移液管 滴定法（续） 试剂 尿素：分析纯 尿素缓冲液：4.45g磷酸氢二钠和3.40g磷酸二氢钾溶于水并稀释至1000ml，再将30g尿素溶于此缓冲液中。 0.1mol/l盐酸 0.1mol/l氢氧化钠标准溶液 标定方法：取基准邻苯二甲酸氢钾0.6g，溶于50ml水中，加热至沸，加入2～3滴酚酞指示剂，用配制的氢氧化钠标准溶液滴定至呈粉红色30s不退色为终点。以下列公式计算浓度： M＝m/(V×0.2042) 式中：m：邻苯二甲酸氢钾质量，g； V：消耗氢氧化钠体积，ml。 滴定法（续） 操作方法 称取0.2000g试样，转入比色管中，加入10ml尿素缓冲液，立即盖好盖子并剧烈摇动。置于30±0.5℃恒温水浴上准确保持30min后立即加入10ml0.1mol/l盐酸，迅速冷却到20℃，将比色管内容物全部转入烧杯，用水冲洗比色管2～3次，立即用标准氢氧化钠溶液滴定至PH＝4.7。 另取比色管做空白试