PCR技术的原理及方法.pptVIP

1 PCR技术简史 2 PCR的原理 3 PCR实验设计方法 4 几种重要的PCR衍生技术 5 PCR技术的应用 Kary B. Mullis（穆利斯（美）） 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。 1 PCR的发展历史 2 PCR的原理 3 PCR实验设计方法 4 几种重要的PCR衍生技术 5 PCR技术的应用 低温退火：使引物与模板DNA 结合 适温延伸：72℃，延伸时间由扩增片段长度决定 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 经典循环参数（500bp以内） 1 PCR的发展历史 2 PCR的原理 3 PCR实验设计方法 4 几种重要的PCR衍生技术 5 PCR技术的应用 ３PCR实验设计方法(How to do PCR) 1）PCR的模板要求 a. 来源及种类：PCR模板可以来源于任何生物，单、双链DNA均可 b. 纯度：要求不高，样品中存在一定量的蛋白质或其他有机物对实验结果影响不大。甚至可以将细胞裂解物直接用于扩增。有时样品中含有抑制DNA聚合酶活性的物质，可通过稀释淡化对酶的影响。 c. 用量： 一般100ng DNA模板/100?L，模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 (1)引物序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。 (2)长度15-30bp为宜，过短降低特异性，过长会导致其延伸温度大于7２℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应； (3)碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶堆积现象,G+C含量控制在45-55%左右； (4)引物内部避免形成二级结构 (5)两引物间避免有互补序列 (6)引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。 DNA Pol. 分两类: 一类具有校正功能(3’-5’外切酶活性)，如vent, pfu, pwo； 另一类不具有校正功能，如Taq DNA Pol。 酶用量0.5-2.5 U/50 ?l，酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 dNTP浓度应该在20~200 uM，浓度过高可加快反应速度，同时增强了错配率和实验成本；反之，低浓度可导致反应速度降低，但可提高实验的精确性。 Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 浓度0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。 1 PCR的发展历史 2 PCR的原理 3 PCR实验设计方法 4 几种重要的PCR衍生技术 5 PCR技术的应用 4 几种重要的PCR衍生技术 反转录PCR技术（RT-PCR） 反向PCR技术 不对称PCR 荧光定量PCR技术 锚定PCR 1）反转录PCR技术（RT-PCR） 　　反转录PCR (Reverse transcription, RT-PCR)是将RNA的反转录反应和PCR反应联合应用的一种技术，即首先以RNA为模板，在反转录酶的作用下合成cDNA，再以cDNA为模板通过PCR反应来扩增目的基因。 　　RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定量分析的有效方法。它具有敏感度高，特异性强和省时等优点。 1 PCR的发展历史 2 PCR的原理 3 PCR实验设计方法 4 几种重要的PCR衍生技术 5 PCR技术的应用 5 PCR技术的应用 1) 基因克隆 2) 基因表达的定性和定量检测 3) 检疫 4) DNA分子标记 1) 基因克隆 2) 基因表达的定性和定量检测 　 植物营养学研究、植物发育学研究、植物抗逆机理研究、转基因植物的检测、病原菌的检测、植物与微生物互作机理研究、植物抗病性检测、信号转导、环境对植物基因表达的影响等。 3) 检疫（害虫、病原菌、病毒） ?? 近年来，植物病毒PCR检测工作进展很快，现已有20多个病毒组，100多种病毒进行了PCR检测，其灵敏度比ELISA和核酸杂交法要高。其中用于检测RNA病毒的RT-PCR技术在甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）、烟草脆裂病毒（TRV）等多种病毒检测中取得成功。 1990年佐野辉男成功地用RT-PCR检测出甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV） ；Nishiguchi等（1995）用RT-PCR技术从牵牛叶上检测出SPFMV-S（强毒系统）、SPFMV-O（普通系统）