SOP-SC-0301蛋白质提取控制程序.PDFVIP

最佳实践规范及标准操作流程文件汇编 V2.01 上海生物样本库 最佳实践规范及标准操作流程 文件汇编 （第二版） 2010年5月 最佳实践规范及标准操作流程文件汇编 V2.01 上海生物样本库 质量管理体系文件 文件名称 蛋白质提取控制程序 编号 SOP-SC-031-01 批 准 人 批准日期 实施日期 蛋白质提取控制程序 1.目的 规定从人体组织中提取蛋白质的工作程序和技术要求。 2.适用范围 适用于从人体组织中提取蛋白质(如总蛋白、细胞膜蛋白、细胞核蛋白和细 胞质蛋白等)和保存蛋白质。 3.定义和术语 3.1 破碎 指用物理、化学、等方法来破坏细胞膜从而将胞内物质释放至周围环境的过 程。 3.2 提取 指用适当的溶剂和方法，将经过处理或破碎的细胞中被提取的蛋白质充分释 放出来并与杂质分离的过程。 4.职责 4.1 样本库实验技术员负责从不同样本中提取蛋白质。 5.设备和器材 见正文内容 6.正文 6.1 组织蛋白的提取 6.1.1脏器组织的选择及预处理 新鲜获取的脏器组织用缓冲盐溶液洗去残留血液和污染物，迅速剥去脂肪和 筋皮等结缔组织，冲洗干净。用组织剪或手术刀将组织分离成1cm3左右的小块。 1 最佳实践规范及标准操作流程文件汇编 V2.01 最好选择新鲜的组织，但有些情况下，如果是以小块组织快速冰冻并且保存时间 不长的话，也可选用冰冻组织。建议冰冻组织保存在-50℃以下，因为由于冰晶 形成导致的溶媒体蛋白酶的释放可能引起蛋白的降解。对于易分解的蛋白质，应 选用新鲜材料制备。 6.1.2组织的破碎 人们所需的蛋白有些分泌于细胞外，用适当的溶剂可直接提取；多数存在于 细胞内，游离在细胞质中或与细胞器紧密结合。而欲提取存在于细胞内的物质时， 必须将细胞破碎。脏器的细胞膜较脆弱极易破损，往往在组织绞碎或提取时就破 坏了。破碎的主要目标是用最快的速度得到最大程度的细胞破碎率，并能保证蛋 白质的完整性。 A.匀浆法 电动玻璃匀浆器常用于匀浆肝、心、肌肉等软组织的匀浆，通常以500～1500 rpm的速度，匀浆3～6次，每次5～10秒。 手动玻璃匀浆器常用于脑组织的匀浆，匀浆10～20次。 刀片式和肉切式组织匀浆器以1000～3000 rpm的速度，匀浆3次，每次20～ 30秒。次间暂停几秒。 匀浆过程应注意维持低温。玻璃匀浆器可外置冰水浴，其他匀浆容器可预冷 或在冷室内进行匀浆。 B.超声法 将处理的组织混悬在至少两倍体积的缓冲液内，将超声探头没入混悬液内进 行超声破碎。 超声波的频率和作用时间与需要处理的靶物质的体积有关。一般输出功率 100～200W，破碎时间1～10分钟，一般约2分钟。 C.液氮研磨 通常每个冻存管内放入 80mg 组织，迅速放入液氮中冻存。在冷室内将组织 从液氮中取出，立即放入事先用液氮预冷的研钵中，敲碎成小块后迅速用力研磨 至粉末。研磨过程中始终保持研钵内有适量液氮。研磨的程度以肉眼见组织成微 细均匀的粉末即可。注意处理不同的样本时，用不同的研钵，以避免可能的交叉 污染。 2 最佳实践规范及标准操作流程文件