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日本七鳃鳗几丁质酶基因的克隆及功能的初步研究 日本七鳃鳗几丁质酶基因的克隆及功能的初步研究 摘要 七鳃鳗(Lamprey)是处于无脊椎动物与脊椎动物之间最重要的物种，从遗传信息基 础和其进化地位来看，它印记了无脊椎动物的进化历史，又为脊椎动物的起源与进化提 供了丰富的遗传信息基础。 几丁质酶是具有裂解几丁质多聚物之间B．1，4．糖苷键能力的一种水解酶，在许多 物种中广泛存在。但是，包括人类在内的哺乳动物中，至今尚未发现几丁质的存在，却 相继发现了体内存在几丁质酶。近几年研究证明，哺乳动物几丁质酶可能在机体抵抗真 菌感染方面扮演重要角色。但是关于其如何抵抗真菌的机制及在不同物种中的进化关系 目前还不是很清楚。由于七鳃鳗具有特殊的进化地位，所以通过研究七鳃鳗几丁质酶的 功能，可以更帮助理解哺乳动物几丁质酶的进化关系，分析其功能的演变过程。 本论文以日本七鳃鳗为研究对象，根据实验室前期所建立的肝脏eDNA文库中的几 丁质酶EST序列，利用RACE(RapidAmplification 鳗几丁质酶基因，对序列进行了生物信息学分析；利用实时定量PCR、Northernblotting 等技术，检测了日本七鳃鳗几丁质酶基因在不同组织和性别中的表达情况；初步研究了 日本七鳃鳗几丁质酶的抗菌功能。具体研究结果如下： 其中5’UTR为104bp，3’UTR为1129bp，ORF长为1575bp。 (2)经生物信息学分析，该几丁质酶编码了524个氨基酸，N端带有23个氨基酸的信号 肽，属于18家族几丁质酶。预测的分子量为57．6ll①，理论等电点为7．22。 8家族哺乳动物几丁质酶做进化树分析，发现日本七鳃鳗几丁质酶与壳三糖 (3)通过与1 酶、酸性哺乳动物几丁质酶及输卵管糖蛋白有共同的祖先，可能具有参与先天性免 疫、适应性免疫反应及发育调控的潜在功能。 (4)分析了几丁质酶在日本七鳃鳗各组织中的表达情况，其中在肝脏和唾液腺中高表达， 在肠中有较高表达，在生殖腺和血液中低表达或不表达。值得注意地是，该几丁质 酶基因在雌性日本七鳃鳗肝脏中的表达量比雄性高100多倍。由于日本七鳃鳗正处 于性腺发育阶段，推测动物几丁质酶可能具有参与发育调控的新功能。 (5)分别用真菌和细菌在日本七鳃鳗体内注射。菌刺激后几丁质酶在各组织中的表达量 显著增加，对四种菌均有不同程度地反应，该现象初步证明了几丁质酶参与先天性 免疫应答，可为研究七鳃鳗的免疫模式提供参考。而且也提示了几丁质酶将在临床 抗真菌治疗方面具有潜在的应用价值。 关键词：日本七鳃鳗；几丁质酶；微生物病原菌；性腺发育；抗真菌 日本七鳃鳗几丁质酶基因的克隆及功能的初步研究 一■ ● ■ ■ ■ ■ 一 ■ 一 一 ● 一 UI onI and l I mI ontunctI OnOt ng Pre narystudy chi ti nase—codi from nggene Lampetrajapon／ca Abstract most theconnectionbetweeninvertebratesand Lampreys，theimportantspecies，are must the of on evolution invertebratesbased vertebrates．Theyimprint history genetic iI]面Hna矗onand therich basesfor evolutionarylocation．Therefore，lampreysprovide genetic the andevolutionof origin vertebrat