第3章 沉淀技术讲解.ppt

Any chromatography separation will be a compromise between speed, capacity, resolution and recovery. The next few slides show the shift in focus with respect to these parameters, during a purification procedure. For a good description of this and the next two slides: see Ion Exchange Chromatography - Principles and Methods, code no 18-1114-21 ed. AA, p. 109 - 112. Normalemnte los procesos de purificación empiezan con grandes volumenes procedentes de extractos crudos o cultivos cellulares. Rapidez: Para reducir al máximo el tiempo de aplicación de la muestra y evitar proteolisis u otros efectos destructivos Capacidad: Escoger un gel de alta capacidad nos permitira reducir al máximo la “escala” de equipamiento que necesitamos Sacrificamos resolución. 第三章 沉淀技术 （2）脱水作用 由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。较静电作用占更主要的地位。 第三章 沉淀技术 2、影响有机溶剂沉析的因素 （一）温度 多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此必须预冷，操作要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓。一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高。 第三章 沉淀技术 （二）样品浓度 样品较稀时，将增加有机溶剂投入量和损耗； 样品太浓会增加共沉作用 。 一般认为蛋白质的初浓度以0.5～2%（5 ~20mg/mL）为好，多糖则以1～2％起始较合适。 第三章 沉淀技术 （三） pH值 选择在样品稳定的pH值范围内，通常是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨能力。 第三章 沉淀技术 （四）离子强度 少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度，降低了沉淀效果，通常是在低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。 盐浓度太大或太小都有不利影响，通常盐浓度以不超过5%为宜，使用乙醇的量也以不超过原蛋白质水溶液的2倍体积为宜。 第三章 沉淀技术 3、有机溶剂沉淀法的应用 （一）有机溶剂沉析的特点 优点：分辨能力比盐析高,即一种生物分子或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉析；沉析不用脱盐，过滤比较容易。 缺点：是某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。 第三章 沉淀技术 （二）应用 有机溶剂沉析技术经常用于蛋白质、酶，多糖和核酸等生物大分子的沉析分离。使用时先要选择合适的有机剂，然后注意调控样品的浓度、温度、pH和离子强度，使之达到最佳的分离效果。 沉析所得的固体样品，如果不是立即溶解进行下一步的分离，则应尽可能抽干沉析物，减少其中有机溶剂的含量，如若必要可以装透析袋透析脱除有机溶剂，以免影响样品的生物活性 第三章 沉淀技术 实例 第三章 沉淀技术 等电点沉淀法 1、原理 调节两性生化物质溶液的pH值，以达到某一生化物质的等电点，使其从溶液中沉淀析出而实现分离的技术称为等电点沉析技术。 等电点(pI)是两性物质在其质点的净电荷为零时介质的pH值,溶质净电荷为零，分子间排斥电位降低，吸引力增大，能相互聚集起来，沉淀析出，此时溶质的溶解度最低 第三章 沉淀技术 特点 等电点沉淀法操作十分简单，试剂消耗少，给体系引入的外来物也少，是一种有效的蛋白质初级分离方法，尤其对疏水性较强的蛋白质。其主要优点在于很多蛋白质的等电点都在偏酸性范围内，而无机酸通常价格低廉，因此可以省去除酸的步骤。 第三章 沉淀技术 2、应用 在生化产品的分离纯化过程中，常利用两性物质如氨基酸、蛋白质、多肽、酶、核酸等具有不同的等电点的特性来进行产品的分离