β-地中海贫血基因检测操作规程（益生堂）.docxVIP

β-地中海贫血基因检测操作规程（益生堂）一、目的：对筛查出来的地贫疑似病例和需要进行地贫产前诊断的夫妇提供进一步的确认。二、适用范围：适用于深圳益生堂品牌的PCR扩增、反向膜杂交检测基因点突变技术等分析的操作。三、原理：应用特异的PCR引物选择性地扩增不同类型的β-地中海贫血基因，通过反向膜杂交技术分析α和β地贫基因突变的位点。四、标本收集及标本保存和标本转运：（1）静脉采血：从肘静脉或手背静脉抽取静脉血1mL以上，将血液沿管壁缓慢注入加有EDTA或枸橼酸钠的试管内（不能用肝素抗凝），轻轻混匀，即为抗凝全血。（2）羊水的采集：由临床医师经腹壁行羊膜穿刺取得。采集羊水时速度不宜太快，标本抽取量也不宜太多，一般10-15mL即可。（3）标本一经采集，则应尽快送至实验室检测，抗凝全血室温放置不超过4小时，4℃保存不超过一周，-20℃保存不超过半年，应避免反复冻融。（4）标本装入试管密封，再装入塑料袋中，置冰壶或泡沬箱加冰袋密封运输，在运输过程中应避免剧烈震荡。五、全血DNA提取操作规（一）所需试剂及仪器：试剂由益生堂生物技术（深圳）有限公司提供，包含核酸提取试剂、扩增管、模条、无水乙醇，1.5mL离心管.仪器有黑马和博日扩增仪、台式高速离心机、旋涡振荡器、真空旋转干燥仪、电泳仪、电泳槽、分子杂交仪、凝胶成像系统。（二）实验前准备工作1.准备好1.5mL无菌离心管及无菌吸头。2.变性液在每次使用前应充分摇匀以保证提取质量。（三）操作步骤 （1）在1.5mL离心管中加入250μL充分摇匀的变性液及100μL抗凝全血，充分混匀，室温放置5分钟。也可选择以下操作步骤，以获得更高质量的DNA：在1.5mL离心管中加入1mL无菌水及100μL抗凝全血，充分混匀，室温放置5分钟以裂解红细胞。13000rmp离心1分钟，弃上清，保留管底白细胞块。在白细胞块中加入250μL充分摇匀的变性液，充分混匀至没有白细胞块，室温放置5分钟。（2）8000rpm离心5秒钟，弃去上清，管底可见红褐色沉淀。将离心管倒置在吸水纸上片刻，小心保留管底沉淀。（3）在沉淀中加400μL洗涤液I，旋涡振荡器上充分悬浮沉淀，8000rpm离心5秒钟，小心弃去上清。将离心管倒置在吸水纸上片刻，小心保留管底沉淀。共洗涤3次。每洗涤一次，管底沉淀物颜色会逐渐变浅，洗涤完3次后的沉淀物近无色。如果沉淀仍然带有浅黄色，可用同样方法多洗一次。（4）在沉淀中加500μL洗涤液II，旋涡振荡器上充分悬浮沉淀，8000rpm离心5秒钟，小心弃去上清。将离心管倒置在吸水纸上片刻，小心保留管底沉淀。共洗2次。（5）最后在沉淀中加500μL无水乙醇，旋涡振荡器上充分悬浮沉淀，8000rpm离心5秒钟，小心弃去上清。将离心管倒置在吸水纸上片刻，小心保留管底沉淀。（6）沉淀置于真空旋转干燥仪中干燥约5-10分钟或者56℃干燥箱中干燥约10-20分钟，当沉淀完全干燥成白色粉末后加入100μL溶解液并混匀。离心管置于56℃保温10分钟。8000rpm离心5秒钟，将含有基因组DNA的上清液移到一支新的离心管中，可获得约3-6ug DNA。（7）注意事项： 变性液使用前必须充分摇匀； 变性液和洗涤液I如有沉淀析出请温育溶解后使用；本试剂盒亦可用于培养的细胞基因组DNA的提取；此基因组DNA可用于PCR扩增、限制性内切酶消化等不同的分子生物学实验。 六 羊水DNA快速提取 （一）操作步骤:1.8mL羊水8000rpm离心5分钟，弃去上清小心保留管底沉淀，把管底白色沉淀转移到1.5mL离心管中。（或在1.5mL离心管中加入充分混匀的羊水样本，8000rpm离心5分钟，弃去上清重复以上操作5-6次收集沉淀细胞。） 2．细胞沉淀液转移到1.5mL离心管后，8000rpm离心5分钟，用微量移液器小心吸走部分上清，保留50μL的沉淀，加入125μL充分摇匀的变性液，充分混匀后室温放置 5分钟。 3．8000rpm离心5秒钟，弃去上清，将离心管倒置在吸水纸上片刻，小心保留管底沉淀。 4．在沉淀中加150μL洗涤液I，旋涡振荡器上充分悬浮沉淀，8000rpm离心5秒钟，小心弃去上清。将离心管倒置在吸水纸上片刻，小心保留管底沉淀。共洗涤3次。5．在沉淀中加250μL洗涤液II，旋涡振荡器上充分悬浮沉淀，8000rpm离心5秒钟，小心弃去上清。将离心管倒置在吸水纸上片刻，小心保留管底沉淀。共洗2次。6．最后在沉淀中加250μL无水乙醇，旋涡振荡器上充分悬浮沉淀，8000rpm离心5秒钟，小心弃去上清。将离心管倒置在吸水纸上片刻，小心保留管底沉淀。7．沉淀置于真空旋转干燥仪中干燥约5-10分钟或者56℃干燥箱中干燥20分钟以上，当沉淀完全干燥成白色粉末后加入50μL溶解液并混匀。离心管置于56℃保温10分钟。8000rpm离