第十五章 基因工程与现代发酵工业技术知识.pptVIP

《发酵工程》第 十五 章基因工程与发酵工业主讲教师：双 宝东北农业大学生命科学学院 ;第一节基因工程在现代工业中的应用;基因工程应用的技术路线;一、基因工程在医药工业中的应用;二、基因工程在食品工业中的应用;可用基因工程生产的食品工业用酶制剂 ;三、基因工程在环保工业中的应用;四、基因工程在化学与能源工业中的应用;一 基因工程菌的构建;二 基因工程菌发酵过程;菌 种 筛 选;基因重组菌的培养与发酵的特点: （1）培养工程的角度:营养源浓度的控制（碳源、氮源等）、最适生长条件的控制等； （2）生物学上应考虑:质粒稳定性的控制、质粒拷贝数的控制、转录效率和翻译效率的提高及代谢产物向菌体外的分泌等。 ;基因工程菌生长代谢的特点; 大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是基本恒定的，因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合成速度。 培养条件的改变，都会改变菌体的能量代谢和小分子前体的供应，影响生物大分子的合成和菌体的生长。 ;(一)菌体的生长与能量的关系; 分批培养中选择不同的碳源，连续培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用。 加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。 ; 大肠杆菌中克隆携带氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌体生长速率。 采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿组主细胞，阻止乙酸产生，可提高产量。 ;(二)菌体生长与前体供应的关系; 质粒存在对菌体代谢的影响：中等拷贝质粒（56拷贝）的工程菌中与前体合成有关的酶增加，这些酶的基因大多受终产物的反馈调节。 高拷贝质粒的工程菌（240拷贝）中，生长速率和菌体总蛋白合成均减少。这与工程菌大量前体被利用引起前体不足，从而产生“严紧反应”有关。 ; “严紧反应”是当氨酰tRNA不足时,核糖体在密码子上停留,并合成被称为魔点的ppGpp的结果。 ppGpp是一个重要的调控分子。它通过影响RNA链的延申过程减少转录。; 它的浓度增加会导致在合成mRNA和rRNA时RNA聚合酶在模板上的移动产生停顿，RNA链延长速度减慢，使游离的RNA聚合酶浓度降低，严紧控制的启动子如rrnA等的转录减少。 也可能ppGpp是通过干扰RNA聚合酶与PL启动子专一识别反应。 ;四 基因工程菌发酵;;(一)基因工程菌的培养方式;(二)基因工程菌的发酵工艺; 工艺要求：外源基因既高效表达，又有利于产品分离纯化。对发酵影响较大的几个因素有： ⒈培养基的影响 ⒉接种量的影响 ⒊温度的影响 ⒋溶解氧的影响 ⒌诱导时机的影响 ⒍pH的影响 ; ⒈培养基的影响 　 培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持工程菌的稳定性，使外源基因高效表达。常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、硫酸铵、氯化铵等。还有无机盐、维生素等。 ; 不同的碳源对菌体的生长和外源基因表达有较大的影响。使用葡萄糖和甘油对菌体比生长速率及呼吸强度相差不大。但使用甘油菌体得率较大，而使用葡萄糖菌体产生的副产品较多。葡萄糖对lac启动子有阻遏作用。乳糖对lac启动子有利。 ; 在氮源中，酪蛋白水解物有利于产物的合成与分泌。色氨酸对trp启动子控制的基因有影响。 无机磷在许多代谢反应中是一个效应因子，磷浓度不同，影响菌体生长。 ;⒉接种量的影响 接种量是指移入的种子液体积和培养液体积的比例。 接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期。 接种量小，菌体延迟期较长，使菌龄老化，不利于外源基因表达。 ; 接种量大，可缩短生长延迟期，菌体迅速繁衍，很快进入对数生长期，适于表达外源基因。 接种量过高，使菌体生长过快，代谢物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。 ;⒊ 温度的影响; 适宜的发酵温度是既适合菌体的生长，又适合代谢产物合成的温度。高温或低温都会使发酵异常，影响终产物的形成并导致减产。 温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。;⒋ 溶解氧的影响; 发酵时，随DO2浓度的下降，细胞生长减慢，ST值下降，发酵后期下降幅度更大。 外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼吸作用，提高对氧的需求。 维持较高的DO2值，才能提高工程菌的生长，利于外源蛋白产物的形成。 ; 采用调节搅拌转速的方法, 可改变培养过程中的氧供给，提 高活菌产量。 ;⒌ 诱导时机的影响; 在对数生长期，细胞快速繁殖，直到细胞密度达到109/个