第三章讲 基因工程制药.ppt

第三章 基因工程制药;第一节 基因工程制药概述;一、基因工程制药;二、基因工程技术所生产的药物;三、基因工程制药的优点;四、基因工程制药所使用的生物技术;基因工程制药的基本技术;基因工程制药的基本技术;六、基因工程制药生产的基本步骤;1、流程图;2、上游阶段;3、下游阶段;七、基因工程制药生产的化学工艺学要求;八、基因工程的发展;（一）基因工程的历史;（二）基因工程所生产的产品;（三）基因工程的发展方向;基因工程制药的发展经历了3个阶段;第二节、基因工程基本技术与策略;一、 酶切与连接;1、同种限制性内切酶产生的粘性末端连接;2、 同尾酶产生的粘性末端连接;3、不同限制性内切酶粘性末端的连接;4、人工粘性末端的连接--5’突出末端;5、人工粘性末端的连接--3’突出末端;6、粘性末端的添加与更换，利用人工接头Linker;3、在利用PCR扩增基因的同时引入酶切位点;4、 利用中间载体提供酶切位点;1、大肠杆菌的质粒转化;（1）钙离子转化法;（2）电转化法;（3）大肠杆菌的?噬菌体转染;;2、 酵母的质粒转化方法;三、影响转化率的因素;四、重组克隆的检测;1、抗药性检测筛选法;3、限制酶切图谱检测;6、外源蛋白质检测;第三节、基因工程制药生产的基本步骤;一、工具酶的分离纯化（从公司购买）;（一）基因工程制药所用到的工具酶;（二）关于限制性内切酶;1、宿主限制现象;2、限制性内切酶的定义;4、限制性内切酶的作用;5、基因工程所用到的RE;6、影响限制酶作用的因素;线性DNA连接前的末端去磷酸化;（三）关于连接酶;二、基因工程载体的分离纯化;（一）基因工程载体的必备条件;基因工程载体的必备条件;（二）基因工程载体的种类;1、细菌质粒;（2）质粒的特性;（3）质粒的分类;（4）质粒载体的具备条件;（5）常用的细菌质粒;典型质粒1;典型质粒2;典型质粒3;[B]、ColE-I质粒;[C]、pAT153质粒;[D]、Ti质粒;2、真核基因的病毒载体;（1）病毒载体的优点;（2）已经研究的真核基因病毒DNA;[A]、SV40病毒DNA;（A1）SV40病毒DNA的特性;（A2）SV40病毒DNA的基因组;（A3）SV40病毒DNA载体的构建;（A4）SV40病毒DNA载体的使用方法;[G]、腺病毒;[ I ]、逆转录病毒载体;（I1）BD Retro-XTM逆转录病毒通???包装系统;;腺病毒表达系统： ?在寄主细胞中呈游离态，基因瞬时表达 ?侵染分裂期或非分裂期的细胞 ?高水平的蛋白质表达 ?病毒的效价高 ?平均可插入8kb的外源片段 ?会引起体内的免疫反应 ;3、λ噬菌体DNA;（1）λ噬菌体DNA的特性;[A]、λ噬菌体DNA在宿主体内的生活方式;[B]、λ噬菌体DNA的结构;（2）λ噬菌体DNA的改造;（3）λ噬菌体DNA的体外包装;A、λ噬菌体包装的作用 λ噬菌体DNA连接上外源性目的基因，就成为重组DNA分子，但是，重组之后的DNA分子必须经过包装，加上蛋白质外壳形成完整的病毒颗粒，才具有感染宿主的能力。 B、λ噬菌体DNA包装的原理 λ噬菌体DNA的头部蛋白+重组DNA分子+λ噬菌体DNA尾部蛋白，在适当条件下混合，就能够自动地包装成完整的λ噬菌体病毒颗粒。 ;;[C]、λ噬菌体DNA的包装过程;（4）l噬菌体载体的构建;（A） 缩短长度;插入型载体与取代型载体;（B） 改造酶切位点;（C） 增加选择标记;（D） 构建琥珀型突变; ; ; ;4、单链DNA噬菌体--M13载体;5：人工质粒载体--科斯质粒;;[A]、科斯质粒的基本组成;[B]、科斯质粒的特性; ;6、酵母人工染色体;（1）酵母人工染色体的必备元件;（2）酵母 人工染色体的结构; ;三、外源DNA和目的基因的分离和获得;1、操作条件;2、提取方法;3、分离方法;4、纯化方法;（二）不同类别DNA的提取技术;2、细菌染色体DNA的提取;3、真核生物DNA的提取;4、病毒DNA的提取（方法一）;4、病毒DNA的提取（方法二）;（三）目的基因的制备;2、化学合成法;（1）化学合成法的概念和分类;（2）化学合成法的优缺点;3、从基因文库中分离----分子杂交分离法;（2）构建基因文库的步骤;4、逆转录法;（4）逆转录法的具体步骤; mRNA的分离;;cDNA的克隆和重组;（D2）cDNA的片段与载体的连接 （1）借助同型多聚体尾巴的连接方法----用3-末端脱氧核苷酸转移酶催化，在cDNA的末端加上polyG（或者polyT）的尾巴、而在载体的末端加上polyC（或者 polyA）的尾巴，就能够实现cDNA的片段与载体DNA的连接。 （2）加人工接头的连接法----所谓加人工接头的连接法，是指用采用T4DNA连接酶，在cDNA的末端加上人工接头，然后再使用