分子原位杂交技术课件.ppt

原位杂交技术 in situ hybridization 核酸分子杂交技术 在研究DNA分子复制原理的基础上发展起来的一种技术。两条核苷酸单链片段，通过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA双链分子 按其作用方式可大致分为两种：固相杂交和液相杂交 液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。液相分子杂交技术包括吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等 固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上（常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。固相杂交包括： 菌落原位杂交（colony in situ hybridization）、 斑点杂交（Dot blot）、 Southern印迹杂交（Southern blot） Northern印迹杂交（Northern blot） 组织原位杂交（Tissue in situ hybridization），即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术 原位杂交技术的基本原理 利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的形成，出现稳定的双链区，形成杂交的双链。 1.两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 双键分子 2.应用带有标记的（有放射性同位素，如3H、35S、32P，荧光素、生物素、地高辛等非放射性物质)DNA或 RNA片段作为核酸探针,与组织切片或细胞内待测核酸(RNA或DNA）片段进行杂交 3.用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的 mRNA或DNA 的存在与定位 用原位杂交术，可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。 此方法有很高的敏感性和特异性，可进一步从分子水来探讨细胞的功能表达及其调节机制。已成为当今细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。 原位杂交组织化学技术发展 1961年，Hall 液相核酸杂交技术 1969年，Gall 和Pardue 用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。 1969年，Buongiorno-Nardelli和Amaldi John 利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，创造了原位杂交细胞或组织化学技术。 Orth（1970）应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交检测了病毒DNA在细胞中的定位，但当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞，探针均采用同位素标记。 由于同位素标记探针具有放射性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等缺点，科学工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交。 Bauman（1981）等首先应用荧光素标记cRNA探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功。 Shroyer（1982）报道用2，4二硝基苯甲醛（DNP）标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，然后用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针。 这两种方法至今仍有采用，但因敏感度不够高，应用不够普遍。　　 Pezzella（1987）创建了用磺基化DNA探针来做细胞或组织原位杂交的方法，其基本原理是使DNA探针的胞嘧啶碱基磺基化，利用单克隆抗体识别磺基化探针，再通过免疫组化方法显示结合的单克隆抗体，从而对杂交结合的探针进行定位。 本法的优点是磺基化DAN探针标记简便，不需作缺口平移标记，敏感度也较高。 生物素标记探针技术是Brigat（1983）首先建立的，它利用生物素标记的探针在组织切片上检测了病毒DNA，通过生物素与抗生物素结合，过氧化物酶-抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞中的定位。 生物素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。 上述生物素标记技术又叫酶促生物素标记技术。另一种叫光促生物素标记核酸技术（1985） ，该技术是用光敏生物素（Photobiotin）标记核酸。目前应用的光敏生物素有乙酸盐和补骨脂素生物素，它们都是由三个部分组成：光敏基团、连结臂和生物素。在强光下，不需酶反应，光敏生物素的光敏基团即可与核酸中的碱基相结合。 光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也不低，但标记效率不高，每100～150个碱基才能标记一个生物素，对于短的基因探针特别是寡核苷酸探针不宜使用，以免因标记数过少而影响灵敏度。 近年来，地高辛（Digoxigonin）标记技术引起科技工作者的极大兴趣。Boeringer Mannhem Bio－chemisca于1987年将地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场。 和其它非放射性标记物一样，地高辛较放射性标记系统安全，方便、省时间。同时在敏