生物实验方案.doc

实验方案 1. PCR 2. Topo 复制 3. 变形转化 4. Minipre DNA 5. 酶切 6. DNA 胶化回收和纯化 (参照 Qiagen 记录) 7. 连接酶 8. 阳性克隆对照 8. GST 融合蛋白质准备 I. Protocol for PCR with Taq DNA Polymerase II. TOPO? TA Cloning—to create a Gateway? entry clone III. Transformation IV. Protocol: QIAprep Spin Miniprep Kit Using a Microcentrifuge V. DNA ligation VI. DNA gel extraction and purification V II. DNA enzyme digestion V III. GST Fusion Protein Prep 课件与幻灯片 1. 分子生物学临床诊断应用 2. 非典型肺炎和 AIV PCR 2.1避免污染 2.2PCR只提供超过10一个目标脱氧核糖核酸序列的百万个拷贝的生产从少量分子。 这个技术敏感性意味着不应该沾染样品与也许在实验室里环境居住的任何其他脱氧核糖核酸或早先被放大的产品(amplicons). 2.3 除了后来的反应产品分析外，DNA 样品准备，反应混合集合和 PCR 过程，都应该在分开的区域进行。 2.4 建议使用装备有紫外线灯的 Laminar 流程内阁装置来混合反应试剂. 2.5 应该为脱氧核糖核酸洗净和每个反应设定佩带新鲜的手套. 2.6 进行DNA 样品和反应混合准备时 , 我们强烈推荐使用热衷的船加样枪及气溶胶滤膜。 2.7 PCR 反应试剂应该被分开的准备而且专门为该实验设计的。除了引物和 Taq DNA 聚合酶外, 所有的试剂都须经高压灭菌处理, 并且要将试剂小剂量分装贮存在指定的 PCR 反应管中,并与其他的 DNA 样品分离开来。 2.8 必须不定时对模板DNA反应进行监控,以确保其没有受到污染 .DNA这只是一个比较粗糙实验设计。有关 PCR 实验室装备和仪器维护的详细指令在 PCR 方法和应用软件3,2,S1-S14,1993中可以查找得到. 一.反应混合体系的准备 建立多个平行反应体系,在单一反应混合管中加入水,dNTPs ，引物和 Taq DNA 聚合酶, 然后分别进入各管中进行消化，接着添加适量MgCl2 和模板 DNA 。 设置这个反应方法使吸取错误的可能性减到最小并且通过减少试剂调动的数量节省时间。 二.配制反应混合体系 1.DNA融化后进行低涡流的短暂离心分离机分离。 2.将装有融合蛋白的试管在旋涡混合器上作短暂混合并进行离心，接着在PCR反应板上滴加反应终止液. 试剂 终浓度 反应体系总体积50ul 灭菌蒸馏水 未知 10X Taq buffer 1X 5μl 2mM dNTP 混合 0.2mM/每一 5μl 引物I 0.1-1uM 适量 引物II 0.1-1UM 适量 Taq DNA 聚合酶 1.25ul/50ul 适量 25mM MgCl2 1-4mM 适量 模板 DNA 10pg-1μg 适量 表为选择 25mM MgCl2 的反应容量管： 反应混合液中 MgCl2 终浓度 1.0 1.25 1.5 1.75 2.0 2.5 3.0 4.0 25mM MgCl2 加入量（μl） 2.0 2.5 3.0 3.5 4 5 6 8 3. 柔和漩涡样品并简单惊醒离心分离收集沾在管壁所有反应液. 4. 用半容量的矿物油覆盖样品或增加适当的相当数量蜡。 如果热量cycler 装备一个激昂的盒盖，这一步可以省略。 5. 安置样品在 thermocycler,进行PCR. 反应混合物的组分 模板DNA 通常数量模板脱氧核糖核酸是在0