单克隆抗体与基因工程抗体制备教程.pptVIP

单克隆抗体的性质鉴定 Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法 特异性测定：抗原类似物的交叉反应 效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示? 表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞?争抑制法，相加指数法及微机集群分析 亲和性测定：测定亲和常数K 杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色体40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条 McAb靶抗原分子量：常用western blot 免疫动物 培养骨髓瘤细胞 收集致敏的B淋巴细胞 收集骨髓瘤细胞 细胞融合 HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞 检测筛选阳性细胞 克隆化培养（反复3-5次） 获得稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株 McAb的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水） McAb 纯化及鉴定 单克隆抗体特性 优点： 理化性状高度均一，生物活性专一，只与一种抗原表位发生反应，特异性强，纯度高，易于实验标准化和大量制备 缺点： 制备复杂，价格昂贵；反应强度不如多克隆抗体；应用有一定的局限性等等 单克隆抗体在医学中的应用 检验医学诊断试剂 （1）病原微生物抗原抗体的检测 （2）肿瘤抗原的检测 （3）免疫细胞及其亚群的检测 （4）激素测定 （5）细胞因子的测定 蛋白质的提纯 肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术 基因工程抗体与抗体库技术 单抗体内应用和疗效受限原因： 1.鼠源性单抗对人体有较强的免疫原性 2.注入人体的单抗在肿瘤部位的摄取量甚少 3.生产成本高,难于普及应用 人杂交瘤技术未获真正突破原因: 融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不能随意免疫 新思路：尽量减少抗体中的鼠源成分，但又尽量保留原有的抗体特异性。 基因工程抗体：根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体，主要包括 嵌合抗体、人源化抗体、小分子抗体、抗体融合蛋白和双特异性抗体。 抗体库技术：用细菌克隆取代B细胞克隆表达抗体，不经细胞融合，甚至不经免疫，制备针对任何抗原的单克隆抗体。 嵌合抗体(chimeric antibody) 从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。 特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。 人源化抗体(humanized antibody) 1. 将小鼠的CDR序列移植到人抗体可变区框架中，产生的抗体称为CDR移植抗体。 2.将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体 单克隆抗体与基因工程抗体制备 多克隆抗体(Polyclonal antibody) 概念 给动物接种抗原所获得的免疫血清或抗血清，是多种抗体的混合物,它是由多种抗原决定簇刺激多株B细胞增殖分化所产生的，称为多克隆抗体。 存在的问题 为不均一物质特异性和亲和力差, 批间重复性差， 用于免疫学检测容易出