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免疫学检测原理 细胞：各类免疫细胞膜表面表达的标志和功能；细胞亚群的数量和功能 分子：各类Ig、C、CK、CKR、AM表达水平和活性。 相关基因：表达与调控、遗传多态性、基因分型。 免疫细胞的检测 一、免疫细胞的分离与纯化 外周血单个核细胞的分离（F-H密度梯度离心） 原理：用密度介于1.077 的分层液，将肝素抗凝 全血叠加在分层液上， 离心后形成不同层次液 体和细胞区带，分离除 PBMC. 淋巴 细胞的纯化与亚群的分离 1、淋巴细胞：经淋巴细胞分层液分离的PBMC用黏附法去出单核细胞 2、淋巴细胞亚群的分离 E花环 尼龙棉柱法 FCM: MACS: 3、小鼠可从脾脏获得单个核细胞、从腹腔获得巨噬细胞 淋巴细胞及其亚群检测 免疫细胞的功能 T细胞增殖实验 原理：活细胞的线粒体作用于MTT，可生成兰黑色甲赞产物，其生成的量与细胞代谢活性呈正比。 * 以10%FCS-1640培养基将PBMC浓度调至2?105/ml，加 至酶标孔中，100ul/孔,并加入一定浓度的PHA. * 培养96h； * 弃上清，加入MTT（5mg/ml），10ul/孔； * 继续培养2-4h； * 加入DMSO 100ul/孔，混匀； * 酶标仪测定各孔的OD值。 免疫分子的检测 免疫球蛋白的检测（免疫比浊） ELISA检测抗体 细胞因子及 受体检测 一、生物学方法 二、免疫学方法检测 ELispot(Enzyme-Linked Immunosorbent spot)CK 免疫标记技术（immunolabelling technique）:是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。 特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位. 分类：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定。 流式细胞术在免疫细胞研究中的应用 1．淋巴细胞表型与亚群、结构与功能分析 2．细胞表面分子如CD69、CD25、CD71、 CD154和MHC分子和黏附分子等； 细胞因子如IFN-?、TNF-?等的表达 3．T细胞增殖、分化及记忆的检测 4．T细胞效应、凋亡的检测 PCR-SSP检测HLA-B27 一、实验目的 掌握HLA基因分型的原理，学习PCR-SSP基因分型方法。 二、实验原理 编码HLA的基因具有高度的多态性，每一个基因座位上有众多的复等位基因，而每一个等位基因都有其各自的DNA序列，因此可根据编码各种HLA抗原的等位基因的碱基序列设计并合成与之互补的寡核苷酸作为相应的序列特异性引物（ sequence specific primers ，SSP），待测样本中的HLA等位基因能用SSP进行扩增。特异性引物仅扩增与其互补结合相应的特异性HLA等位基因，而不扩增其他的非特异性的等位基因,通过琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物。 PCR-SSP分型操作过程示意图 提取待测标本基因组DNA↓采用SSP引物进行PCR扩增相应HLA基因↓扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物↓根据PCR产物的出现判断待测标本的HLA型别 PCR-SSP技术鉴定 HLA等位基因 Specific bands can be seen with HLA-B27(+) samples DNA-binding dyes 使用一种可与DNA双链结合的荧光染料(SYBRGreen), 这种染料只在与双链DNA结合并发荧光，未结合的几乎不发荧光。 可与目的序列特异性杂交的单链探针，长度为20～30bp,此探针的的5’端含有一个荧光报告基团,其发射的荧光可被探针3’端的荧光淬灭基团吸收或抑制 而能与靶基因特异性杂交的探针引物在延伸的过程中，5’荧光报告基因被切割下来，并发出荧光。 * 密度梯度离心分离淋巴细胞亚群 免疫组织化学（检测T细胞及亚群，AM） NK细胞活性检测 效应细胞 靶细胞 释放LDH 丙酮酸 乳酸 乳酸脱氢酶(LDH) NAD+ NADH+H+ PMS NBT 甲替（OD570nm） NK细胞活性测定 效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞） 靶细胞的制备 效-靶细胞相互作用 酶促反应 结果判读 A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 实验组 自然释放组 最大释放组