PCR实验基本原理及实验室布局.pptVIP

principle method in PCR principle method in PCR PCR技术的基本原理和方法Principle and Method for PCR principle method in PCR * 一、PCR 技术的基本原理 principle method in PCR * PCR — 聚合酶链式反应 优点：方法操作简单，反应快速敏捷，结果可靠 原理：与细胞内发生的DNA复制过程十分相似。 是在模板、引物和4种dNTP（包含A、T、C、G四种碱基的脱氧核苷酸）存在条件下，依赖于DNA聚合酶体外扩增目的DNA的反应。 principle method in PCR * 模板 是指包含待扩增片段（目的片段）的一段DNA，可以是细菌和病毒的基因组DNA，细菌质粒DNA，也可以是病毒RNA经体外逆转录后形成的cDNA。 引物 是指与目的片段两翼互补的一对单链DNA片段，一般由17-30个寡核苷酸组成。 DNA聚合酶 耐热。商品化名称为Taq 酶 principle method in PCR * PCR反应的3个步骤 变 性(denaturation): 通过加热使DNA双链解开，成为单链DNA的过程 principle method in PCR * 退 火(annealing):反应混合液冷却至某一合适的温度，两个引物分别与两条单链模板的互补区域结合的过程 principle method in PCR * 延 伸(elongation):反应温度再次升高，在DNA 聚合酶的作用下、 Mg2+存在的条件下，4种dNTP从引物的3’端开始参入，引物沿5’-3’方向延伸，合成出新生的DNA互补链。 principle method in PCR * principle method in PCR * 二、PCR反应基本方法 核酸提取和纯化  核酸提取是分子生物学实验的基础，对于其下游工作是非常重要的。高质量的核酸是PCR、实时PCR等实验的基础。因此选择好的提取方法和试剂是非常重要。 principle method in PCR * DNA 的提取和纯化 细菌裂解获得DNA，裂解可以采用多种方法，这些方法包括用去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。 DNA 的提取和纯化试剂盒。 principle method in PCR * RNA的提取和纯化 RNA提取的五个关键点： 样品细胞或组织的有效破碎； 有效地使核蛋白复合体变性； 对内源RNA酶的有效抑制； 有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离； 有效除去多糖含量高的样品中的多糖杂质； 抑制ＲＮＡ酶活性。 principle method in PCR * Trizol法提取RNA的实验流程 提取物：血清、血液、细胞培养液、鸡胚尿囊液等液体中的病毒。提取时尽量在人少时进行，防止空气中RNA酶的污染。所用一切物品也应是无RNA酶的。 提取物原液500ul，TRIzol （Gibco公司） 500ul，充分混匀，室温放置10min。 加入200ul的氯仿，用力震荡（溶液充分乳化），室温放置10min 。 离心（ 4℃、13000r/min、15min），取上层液相移入另一管。 加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min。 离心 （4℃、13000r/min、15min），用枪小心吸去上清。 1ml75%乙醇，离心（ 4℃、8000r/min、10min），吸去上清，干燥5min。 加入适量DEPC处理水，55-60℃水浴10min溶解总RNA，测OD值。 建议立即做RT。若要保存，可在上一步加入乙醇后冻存于－70℃。  principle method in PCR * DNA、RNA提取试剂盒 自动核酸提取系统 生物梅里埃公司NucliSENS? easyMAG?系统 FastPrep?(FP220A)快速核酸提取仪 美国应用生物系统公司 6100型核酸提取仪 富士QuickGene 610L型自动核酸提取系统 principle method in PCR * RT-PCR RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以 cDNA 为模板，扩增目的片断。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。 principle