测定其含氮量再换算为蛋白质含量的凯氏定氮法.PPT

操作方法 1、制作标准曲线 取两组测定的A560值的平均值，即A560为纵坐标，蛋白质 浓度为横坐标，绘制标准曲线。 2、样品测定 福林-酚法（双缩脲法的发展） 两步反应 (1)在碱性条件下，蛋白质(肽键）与铜离子作用生成蛋白质—铜络合物。 (2)此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸(Ｆolin试剂)还原，混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物) （A750)。 杜马斯法（燃烧法） 样品在高温下（700-800℃）燃烧，释放的氮 气由带热导检测器（TCD)的气相色谱仪测定。测得 的含氮量转换成样品中的蛋白质含量。 几种蛋白质测定方法比较 凯式定氮法 双缩脲 杜马斯 福林-酚 原理 装置 溶剂 时间 灵敏度 干扰 总氮量 蛋白氮 总氮量 蛋白氮 凯式定氮装置 分光光度计 高温装置、GC 分光光度计 浓硫酸 用量较少 不需要 福林-酚试剂 长 简单快速 3min 简单快速 较低 低 高 高 较小 有干扰 较小 酸类及柠檬酸类 氨基酸态氮的测定 氨基酸态氮的测定 双指示剂甲醛滴定法：原理、试剂、测定方法、结果计算、说明 电位滴定法：原理、试剂、仪器、测定方法、结果计算 一、双指示剂甲醛滴定法 氨基酸本身有碱性-NH2基，又有酸性-COOH 基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，与-NH2结 合，碱性消失，再用强碱来滴定-COOH基。 双指示剂：百里酚酞+中性红指示剂 同时取两份样 ① +中性红，用NaOH滴定 ② +百里酚酞+中性甲醛+NaOH滴定 操作方法 移取含氨基酸约20～30mg的样品溶液2份，分别置于250mL锥形瓶中，各加50mL 蒸馏水，其中1份加入3滴中性红指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至由红变为 琥珀色为终点；另1份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20mL，摇匀，静置1分钟，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终点。分别纪录两次所消耗的碱液mL数。 式中 c ——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L; V1——用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL; V2——用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL; m——测定用样品溶液相当于样品的质量，g 0.014——氮的毫摩尔质量，g/m mol 结果计算 氨基酸态氮（%） 二、电位滴定法 根据氨基的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱 性，使羧基显示酸性，将酸度计的玻璃电极和甘汞 电极同时插入被测液中构成电池，用NaOH 标准溶 液滴定，根据酸度计指示的pH 值判断和控制滴定的 终点。 pH 8.2 9.2 磁力搅拌器 酸度计的使用操作规程 调节开关 用缓冲溶液校正pH计 清洗电极 吸干电极上面的水 把电极插入被测溶液中 测定 清洗并擦干电极 酚酞乙醇指示液：1% 硼砂（标准物质）缓冲液：PH9.22 称取3.8克 Na2B4O7 溶解后，定容至1000mL 甲醛：36%-----38% 0.0500mol/L氢氧化钠标准溶液 (3)试剂 (4) 试验步骤 ①吸取含氨基酸约20mg的样品溶液，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取20.0mL烧杯中，加60mL水，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2（记下消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数，可计算总酸含量）。 ②加入0.1mL甲醛溶液，混匀。再用0.05mol/L氢氧化钠标准的溶液继续滴定至pH9.2，记下消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数。 ③ 同时取80mL水，先用0.05mol/L氢氧化钠溶液调节至pH为8.2，再加入10.0mL甲醛溶液，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH9.2，做试剂空白试验。 式中 ρ------氨基酸态氮质量浓度，g/100mL; c-------氢氧化钠浓度，mol/L； V1-----加入甲醛后耗NaOH的量，mL； V2------空白试验加甲醛后耗NaOH量，mL； V3------测定用样品稀释液的量，mL； M氮----氮的摩尔质量，14.01g/mol； 5-------样品量，mL. （5）结果计算 在测定某厂酱油氨基酸态氮含量时，酱油5g于100mL 容量瓶中，加水定容，混匀后吸取此液2