免疫组化与细胞形态学研究 课件.pptVIP

PAP复合物稳定，不易脱落，灵敏度高。 PAP法反应原理： 抗原+一抗+二抗+PAP复合物+DAB-H2O2显色液 DAB-H2O2 PAP复合物 二抗 生物素 第四节 免疫组织化学染色原理和方法 三、亲合免疫组化 生物素 抗生物素（亲合素、卵白素） 两者能和酶、抗体结合 生物素 第四节 免疫组织化学染色原理和方法 三、亲合免疫组化 LAB法（标记抗生物素-生物素法） (Labelled avidin-biotin method) 用酶标记抗生物素用生物素标记抗体 LAB法反应原理：抗原+一抗+生物素标记的二抗+酶标抗生物素+DAB-H2O2显色液 灵敏度高，特异性强，简洁。 DAB-H2O2 生物素 第四节 免疫组织化学染色原理和方法 三、亲合免疫组化 BAB法（桥连抗生物素-生物素法） (Bridged avidin-biotin method) 用酶标记生物素用生物素标记抗体 BAB法反应原理：抗原+一抗+生物素标记的二抗+抗生物素+酶标生物素+DAB-H2O2显色液 生物素 第四节 免疫组织化学染色原理和方法 三、亲合免疫组化 ABC法（抗生物素-生物素-酶复合物法） (Avidin-biotin-peroxidase complex method) ABC复合物：生物素+酶+抗生物素 生物素 酶 抗生物素 ABC法反应原理：抗原+一抗+生物素标记的二抗+ABC复合物+DAB-H2O2显色液 灵敏度高，特异性强，简洁。 ABC复合物 DAB-H2O2 四、双重或多重免疫组化 第四节 免疫组织化学染色原理和方法 在同一标本上同时或先后显示两种或两种以上的抗原，光镜下根据不同颜色判断不同的抗原成分。 1.双重荧光染色 2.双重酶染色 五、非特异性着色 第四节 免疫组织化学染色原理和方法 染色过程中产生的非靶抗原的着色结果，属假阳性，又称背景着色。应尽量减少或消除。 六、对照的设置 第四节 免疫组织化学染色原理和方法 1.阳性对照： 用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行染色。对照片结果呈阳性。 六、对照的设置 第四节 免疫组织化学染色原理和方法 2.阴性对照： 阴性标本对照：用确证不含已知抗原的标本作对照，结果呈阴性。 六、对照的设置 第四节 免疫组织化学染色原理和方法 2.阴性对照： 空白对照：用缓冲液取代第一抗体进行试验，结果为阴性。 六、对照的设置 第四节 免疫组织化学染色原理和方法 2.阴性对照： 吸收试验：特异性第一抗体用相应的纯化抗原中和吸收，其结合位点全部被外源性抗原结合，不能再与组织内的靶抗原反应，用这种吸收后的第一抗体做免疫染色，结果为阴性。 六、对照的设置 第四节 免疫组织化学染色原理和方法 2.阴性对照： 抑制试验：用未标记抗体与标记抗体先后与标本反应，未标记抗体起到封闭抗原的作用。染色结果减弱或转阴。 3.染色实验组与对照组结果分析表 第四节 免疫组织化学染色原理和方法 阳性对照 阴性对照 替代对照 实验组 结论 1 - - - - 操作错误 2 + + + + 非特异性反应 3 + - - + 受检组织含定位抗原 4 + - - - 受检组织不含定位抗原 六、对照的设置 1. 全部切片均为阴性的原因： ① 染色未完全严格按照操作步骤进行； ② 漏加一种抗体，或抗体失效； ③ 底物中所加H2O2 量少或失效； 七、染色失败的几种原因 第四节 免疫组织化学染色原理和方法 七、染色失败的几种原因 第四节 免疫组织化学染色原理和方法 2.全部切片均为阳性的原因： ①染色过程中抗体过浓，或切片干燥了。 ②缓冲液洗涤不彻底。 ③使用已变色的显色底物溶液，或显色时间过长。 ④抗体孵育时间过长。 ⑤H2O2 浓度过高，呈色速度过快。 以石蜡切片为例 写出组织细胞处理的过程 主要内容 第一节 免疫组织化学的定义 第二节 免疫组织化学中的免疫化学 第三节 组织细胞的处理 第四节 免疫组织化学染色的原理和方法 第五节 免疫组织化学的实际应用 第三节 组织细胞的处理 六、切片 1.切片平整 2.连续切片 3.贴片牢固 4.根据研究目的，调整切片厚度。 （二）切片的注意事项 1. 蜡带不直：修蜡块时不平行 2. 不能切成连续蜡带：切片刀不锋利或刀口与蜡块的角度不适合。 3. 蜡带皱缩：石蜡太软或切片时室温过高，可用冷水浸蜡块。切片太薄。刀口与蜡块角度15o 4. 蜡带有静电不成带：包埋时温度高烫了材料，不易纠正 5. 蜡带翻上不成带：石蜡硬，刀角不适当。 6.盛蜡带的纸盘