专题一1.1-DNA重组技术的基本工具.pptVIP

1967年，罗思和赫林斯基发现细菌拟核DNA之外的质粒可以作为基因转移的运载工具。 1、基因转移载体的发现 二、技术发明使基因工程的实施成为可能 1970年，阿尔伯、内森斯、史密斯在细菌中发现了第一个限制性内切酶。 20世纪70年代初，相继发现多种限制性内切酶、连接酶和逆转录酶。 2、工具酶的发现 1965年，桑格发明氨基酸序列分析技术 1977年，科学家发明DNA序列分析方法。 DNA合成仪问世，为引物、探针和基因获取提供方便。 3、DNA成和测序技术的发明 1972年，伯格成功的构建了第一个体外重组DNA分子。 4、DNA体外重组的实现 这个实验证明了质粒不仅可以作为基因工程的载体，重组DNA还可以进入受体细胞，外源基因可以在原核细胞中成功表达，并实现物种之间的基因交流。表明基因工程正式问世。 1973年，博耶和科恩将重组DNA导入大肠杆菌的DNA中，转录出相应的mRNA。 5、重组DNA表达实验的成功 1980年，科学家首次通过显微注射培育出世界上第一个转基因小鼠。 1983年，科学家用农杆菌转化法，培育出世界上第一例转基因烟草。 6、第一例转基因动物问世 1988年，由穆里斯发明的PCR技术，使基因工程技术得到了进一步发展和完善。 7、PCR技术的发明 专题1 基因工程 1-1 DNA重组技术的基本工具 1-1 DNA重组技术的基本工具 “分子手术刀” ──限制酶 “分子缝合针” ──DNA连接酶 “分子运输车” ──基因进入受体细胞的载体 专一性：识别特定的核苷酸序列，在特定切点切割。 主要从原核生物分离出来 4000种。 1、来源： 2、种类： 3、特性： 5、结果： 形成两种末端 一、“分子手术刀”——限制酶 黏性末端 平末端 4、切割方式： 错位切和平切 A T G C A T G C 磷酸二酯键 1、EcoRⅠ限制酶：能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开形成黏性末端。 2、SmaⅠ限制酶：能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切割形成平末端 。 常见的两种限制酶 　 1、EcoRⅠ限制酶 黏性末端　　　　 黏性末端 2、SmaⅠ限制酶 平末端　　　平末端 连接黏性末端 连接黏性末端和平末端 分类 作用 E·coli DNA连接酶 1、连接酶种类： T4DNA连接酶 二、分子缝合针——DNA连接酶 2、作用部位： 是磷酸二酯键（扶手） 不是氢键（梯子） 两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来 3、DNA连接酶的缝合作用 可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来， DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？ T4 DNA连接酶：把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低 A A T T G C A A T T A A T T DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶的作用 返回 DNA连接酶 DNA聚合酶 相同 点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板 作用对象 作用结果 用途 都能催化形成磷酸二酯键 都是蛋白质 不需要 需要 形成完整的重组DNA分子 形成DNA的一条链 基因工程 DNA复制 DNA连接酶与DNA聚合酶的比较 只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键 在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键 不同来源的DNA片段结合 G A A T T C C T T A A G G A A T T C C T T A A G G C T T A A A A T T C G G C T T A A A A T T C G G C T T A A A A T T C G 用同种限制酶切割 DNA分子的切割和连接 DNA连接酶作用 1、作为载体的必要条件 ①能够自我复制 能在受体生物细胞内复制并表达； ②有一个至多个限制酶切位点 能与目的基因结合 ③有遗传标记基因 便于观察 ④对受体细胞无害 安全、比较容易得到 三、基因进入受体细胞的载体 ——分子运输车 2、常用载体的种类： 质粒、λ噬菌体、动植物病毒 能带着插入的目的基因一起复制 有切割位点 有标记基因，可用含青霉素的培养基鉴别 常用的载体——质粒 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA分子之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。 小结 基因工程 的工具 1、限制酶 来源：主要存在于原核生物中 特性：特异性识别序列、切点 作用部位：磷酸二酯键 2、DNA连接酶 连接磷酸二酯键 种类 E.coliDNA连接酶 T4 DNA连接酶 3、运载 工具 具备的 条件 能在宿