5.3_血红蛋白的提取和分离教材课件.pptVIP

;蛋白质提取与分离的依据 －－蛋白质的物理化学性质：;一、基础知识：;3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（ ）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（ ），移动速度（ ），而（ ）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（ ）移动，路程（ ），移动速度（ ），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。;4、分离过程 ;由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。 如H2CO3/NaHCO3、NaH2PO4/Na2HPO4等;在凝胶中加入SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”， SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间的电荷差别，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。 ;电泳检测结果;样品处理;血液组成成分;1.洗 涤 红 细 胞;采集得到猪血;初次离心后的结果;3次洗涤后的结果;2.释放血红蛋白;磁力搅拌器;3.分离血红蛋白;分离血红蛋白溶液;4.透析血红蛋白;利用透析袋透析;透析过程;纯化－－凝胶色谱操作;（二）凝胶色谱操作;材料：交联葡聚糖凝胶G-75； 20mmol/L磷酸缓冲液 装填:;（2）凝胶色谱柱的装填; ④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、洗脱液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。 ;装配好的凝胶柱;3.样品加入与洗脱;3.样品的加入和洗脱;3.样品加入与洗脱;收集得到的纯化后的血红蛋白;课题3 血红蛋白的提取与分离; 观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。;三、实验结果分析与评价; 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱???的装填有关。;课题3 血红蛋白的提取与分离