5.3《血红蛋白的提取和分离》教材课件(新人教版选修1).pptVIP

血红蛋白 两个α－肽链 两个β一肽链 四个亚铁血红素基团 每个肽链环绕一个亚铁血红素基团， 此基团可携带一分子氧或一分子二 氧化碳，血红蛋白因含有血红素而 呈红色。 血红蛋白的特点： 本课题学习目标 1、主要概念： ①凝胶色谱法 ②电泳法 ③缓冲溶液 ④它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。 主要原理： ①凝胶色谱法分离蛋白质的原理 ②电泳法分离样品的原理 ③缓冲溶液的组成和作用机理 （一） 凝胶色谱法（分配色谱法） 2.凝胶： 大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或 琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。 根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大 小，利用具有网状结构的凝胶，来进行分离。 1.概念： 3.凝胶色谱法的原理 ①当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢; ②而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。 ③依据的特性是：蛋白质分子量的大小。 4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程 （二）缓冲溶液 1.概念: 在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。 能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。 2.作用: 3.缓冲溶液的配制: 通常由1－2 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。 4.提问：在本课题中使用的缓冲液是:__________ , 其目的是: 利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性) 磷酸缓冲液 （三） 电泳： 1.概念： 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 2.原理： ①许多重要的生物大分子，如多肽、 核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 3.类型: 琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动 琼脂糖凝胶电泳示意图 (2)血红蛋白的释放： 加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。 (3)分离血红蛋白溶液： ①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min。②试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 甲苯层（无色透明） 白色薄层固体 红色透明液体 杂质沉淀层（暗红色） 试管中溶液层次 (4)透 析： ①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。 ②透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。 透析过程动画演示 （3）样品加入与洗脱 ①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。 ②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 ③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 ④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 ⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） ⑥注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。