（）PCR技术的原理，实验设计和在临床的应用.pptVIP

目 录 PCR的概念 PCR技术的创建 PCR的原理 PCR的反应体系和方法 PCR的应用 经典循环参数（500bp以内） * 分子生物学基本技术 PCR的概念 Polymerase: DNA聚合酶 聚合酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction) 体内DNA的复制体系 DNA聚合酶（I II III） 拓扑异构酶 解旋酶类 SSB 引物 dNTP Mg2+ 5’ 3’ 基因组DNA 引物 DNA聚合酶 DNA片段体外扩增 PCR技术的创建 Kary B. Mullis PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。 Kary B. Mullis（1944－） Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 酶活性(%) 温度(℃) 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 20 72℃ 94℃ 55℃ PCR循环 PCR的原理 PCR扩增原理 引物 延伸 延伸 5’ 5’ 3’ 3’ 变性、退火 变性、退火 N=N0(1+e)n 总体积 50-100 ?l Buffer 缓冲液 dNTP 原料 Primer 引物 DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶 1 反应体系 PCR的反应体系和方法 PCR技术的基本过程(1) 模板DNA dNTP 引物 Buffer 预变性 模板DNA dNTP 引物 Buffer TaqDNA聚合酶 94oC5’ 2 基本过程 PCR技术的基本过程(2) Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer 循环仪 94℃ 55 ℃ 72 ℃ Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer 72 ℃ 5～7 min 琼脂糖凝胶电泳 PCR技术的基本过程(3) 1）PCR反应成分 （1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100?L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 3 PCR反应条件 （2）引物浓度 0.1-0.5 ?mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 ?l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 （4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。 （5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。 2）循环参数 变性 使双链DNA解链为单链 94oC 20-30秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。 （3）延伸 70-75℃,一般为72℃ 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加 94℃ 30s 55 ℃ 45s 72 ℃ 1min 94℃ 5min ×30次 72℃ 7min 42℃ forever 4 PCR技术的特点 1 ）高度的灵敏性 30轮循环 扩增量达230个拷贝（10