基因工程以及在医药上的应用8.ppt

（六）重组DNA导入受体菌 受体菌条件： ◆安全宿主菌 ◆限制酶和重组酶缺陷 ◆受体菌处于感受态(competent) 感受态(competent) : 指细胞在一定的生理状态可摄取外源性遗 传物质经体内重组成为染色体中的一部分,导 致受体细胞某些遗传性状的改变.经人工处理 能吸收重组DNA分子敏感状态的宿主细胞， 称之为人工感受态细胞． 导入方式： 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection) ◆转化 (transformation)： 以质粒为载体构建的重组DNA分子导入原核细胞的过程. ◆转染 (transfection): 以噬菌体或病毒为载体构建重组DNA分子导入真核细胞的过程. 感染 (infection): 以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建 重组DNA分子,经体外包装成具有感染性 噬菌体或病毒颗粒后,借助于噬菌体或病 毒的蛋白外壳将重组DNA分子注入细菌 或真菌细胞,从而使目的基因得以复制的 过程. （七）重组体的筛选 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 　　　原位杂交 　　　Southern印迹 1. 直接选择法 　　　2. 免疫学方法 　　如免疫化学方法及酶免检测分析等 ３.限制性内切酶图谱 ４.双脱氧终止法测序（sanger法） 目 录 (插入失活法) 抗药性标记选择 组氨酸缺陷 型大肠杆菌 无组氨酸 的培养基 酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因 促进组氨酸合成 λDNA 重组体 标志补救 目 录 α 互补的检测 目 录 原位杂交 目 录 核酸杂交 Southern印迹 目 录 鸡的β肌球蛋白的克隆和检出 目 录 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的基因 连接酶 重组体 转化 体外包装，转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 目 录 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒） 其它 （四）目的基因 cDNA (complementary DNA) 基因组DNA (genomic DNA) （一）目的基因的获取 1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 2.基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)（见第22章） 化学合成获取目的基因 * 化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列 分 子 文 库 基因组DNA文库获取目的基因 　(genomic DNA library) 组织或细胞染色体DNA 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合 * 从基因组DNA文库获取目的基因 目 录 EcoR I Genomic Library Infect cells 限制酶切位点 限制酶消化 除去中间片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色体DNA 限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌 ~20 Kb DNA 片段 cos L R cos ~20 Kb 外源 DNA 片段 基因文库 目 录 cDNA文库获取目的基因 　　(cDNA library) mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 * 从cDNA文库获取目的基因 逆转录酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱水解 T T T T 目 录 引物 cDNA 文 库 基于核酸杂交的筛选; 基于抗原抗体反应的筛选。 在文库中筛选目的基因原理 聚合酶链反应获取 (polyme