实验一培养基的配制与灭菌、消毒技术.docVIP

生物化学与分子生物学 实 验 指 导 书 天津理工大学 环境科学与安全工程学院 2006.7 目录 实验一 蛋白质的变性凝固及沉淀反应 3 实验二 脲酶Km值简易测定 4 实验三 谷物种子中赖氨酸含量测定 6 实验四 蛋白质的颜色反应（米伦氏反应） 8 实验五 蛋白质含量测定（双缩脲法） 9 实验六 酶动力学因子对酶活力的影响（综合实验） 10 实验七 碱裂解法制备质粒DNA 13 实验八 水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 15 实验九 紫外吸收检测DNA的浓度和纯度 17 实验一 蛋白质的变性凝固及沉淀反应 一、目的要求 1 熟悉蛋白质的沉淀反应。 2 进一步掌握蛋白质的有关性质。 二、基本原理 蛋白质受热作用后，其分子内部结构发生变化，常使疏水基暴露于表面，因而失去原有的亲水性质，成为溶解度很低的变性蛋白。蛋白质在其等电点或等电点附近受热作用，则凝固而沉淀。若在稀酸稀碱中加热，由于变性蛋白质带正电荷或负电荷，故不易析出，此时如调节到等电点或等电点附近则沉淀析出，称为结絮。结絮的变性蛋白尚可溶于稀酸或稀碱中。结絮蛋白继续加热，则成较大的块状凝固蛋白，些时即不再溶于稀酸或稀碱中。 蛋白质由于水化层和电荷的存在，因此其水溶液具有亲水胶体的性质。凡能破坏蛋白质水化层和电荷存在的因素，均可使蛋白质从溶液中沉淀出来，这种蛋白质由溶液中析出的现象称为蛋白质的沉淀反应。大多数蛋白质经盐析反应，或在低温下用乙醇或丙酮短时间作用使蛋白质沉淀后，除去上述因素，蛋白质又能溶于原来的溶液中，属于可逆的沉淀反应。但用重金属盐类、生物碱试剂、加酸及加热引起的蛋白质沉淀反应一般均属于不可逆沉淀反应。 三、主要器材、试剂和药品 酒精灯、试管、移液管、胶头滴管、木试管夹、鲜鸡蛋、HCl、NaOH、硫酸铵、硫酸铜、丙酮等。 四、操作步骤 20%蛋白液2ml+1mol/LHCl 2ml 20%蛋白液2ml+1mol/LNaOH 2ml 20%蛋白液2ml+蒸馏水2 ml,置于酒精灯外焰上加热 20%蛋白液2ml，逐渐加入硫酸铵粉末 20%蛋白液2ml加入少许硫酸铜 20%蛋白液2ml加入丙酮10滴 五、实验报告 分别描述上述6个步骤的现象并解释其原因。 实验二 脲酶Km值简易测定 一、目的要求 学习Km的双倒数作图法。 了解酶的性质及Km的含义。 二、基本原理 脲被脲酶催化分解，产生碳酸铵。碳酸铵在碱性溶液内与奈氏试剂作用，产生橙黄色的碘化双汞铵，在一定范围内，呈色深浅与碳酸铵多少成正比。故借比色法可测定单位时间所产生碳酸铵量，从而求得酶促反应速度。 在保持恒定的合适条件（时间、温度及pH）下，以同一浓度的脲酶催化不同浓度的脲分解，于一定限度内，酶促反应速度成正比，因此，用酶促反应速度倒数（１／v）为纵坐标，脲浓度倒数（１／c）为横坐标，依L、K法作图，即可求出脲酶的Km值。 三、主要器材、试剂和药品 无水酒精、尿素（ＡＲ）、Na2HPO4（ＡＲ）、KH2PO4（ＡＲ）、硫酸锌、0.5mol/L NaOH、100g/L酒石酸钾钠、0.1mol/L脲液、脲酶液、碘化钾、碘、汞、奈氏试剂、显色液、1/15 mol/L PB（磷酸缓冲溶液，pH7.0）、豆粉、恒温水浴锅、72型分光光度计、小漏斗、漏斗架、滤纸、移液器、水浴加热锅等 四、操作步骤 取试管５支，编号依下表加入试剂 管号 １ ２ ３ ４ 对照 脲液终浓度／（mol/L） 1/100 1/150 1/200 1/250 1/250 脲稀释液加入体积／ml 浓度／（mol/L） 1/15 mol/L PB(pH7.0) 脲酶液／ml 煮沸脲酶液／ml 0.2 1/20 0.6 0.2 — 0.2 1/30 0.6 0.2 — 0.2 1/40 0.6 0.2 — 0.2 1/50 0.6 0.2 — 0.2 1/50 0.6 — 0.2 摇匀，３７℃水浴１５min 100g/L ZnSO4 蒸馏水 0.5 mol/L NaOH 0.5 3 0.5 0.5 3 0.5 0.5 3 0.5 0.5 3 0.5 0.5 3 0.5 充分摇匀，室温下静放５min，过滤，另取５支中试管，同上编号，接下表加入 滤液／ml 蒸馏水/ml 显色液／ml 1 2 0.75 1 2 0.75 1 2 0.75 1 2 0.75 1 2 0.75 迅速摇匀，用７２型分光光度计，４２０nm，以对照调０，测定各管Ａ值。作图：以脲液终浓度［１／c］为横坐标，１／Ａ（１／v）为纵坐标作图，然后依［１／c］找出对应１／Ａ点，将各点连成延长与［１／c］轴相交，得－１／Km。 五、注意事项 1、操作中，每加一样试剂请务必摇匀，尤其中37℃保温后和加显色液二步。 2、变性脲酶