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将B淋巴细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 （四）McAb技术的基本原理 * * （一）McAb技术的基本原理 （二）抗原和抗体 在ELISA本法要求所用抗原纯度高，抗体效价高、亲和力强。 ELISA所用抗原有三个来源：天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原。 用于ELISA的抗体有多克隆的和单克隆的。 抗血清成分复杂，应从中提取IgG才可用于包被固相或酶标记。 含单克隆抗体的小鼠腹水中的特异性抗体含量较高，可直接进行包被。 ????????????????????????????? ? * 二、单克隆抗体的制备过程 （1）对小鼠进行免疫； （2）建立筛选方法和流程； （3）生成杂交瘤。 * 表4—2 杂交瘤细胞生成的各个阶段和所需时间 动物免疫阶段 初始免疫 一个月到一年 强化免疫 血清测试 方法建立阶段 筛选方法的建立与测试 大约一个月 最后一次强化免疫 杂交瘤细胞生 成阶段 细胞融合 大约一个月 筛选阳性克隆 阳性克隆扩增及冻存 单细胞的克隆生长 筛 选 * (三) 单克隆抗体在检测中的应用 1、单克隆抗体在食源性病原菌及其毒素检测中的应用 2、单克隆抗体在真菌及其毒素检测中的应用 表4-5主要食物中毒和食物感染的细菌 细菌种类 涉及到易感染的产品 金黄色葡萄球菌 肉类食品、甜食、乳制品 沙门菌属 烹调和重新加热的肉类和肉产品 副溶血弧菌 海鲜类食物 产气荚膜梭菌 烹调和重新加热的肉类和肉产品 腊状芽孢杆菌 米和其他淀粉食物 肉毒梭菌 蔬菜的罐头（豆和玉米）、熏鱼 空肠弯曲杆菌 家禽、牛奶 埃希氏大肠杆菌 主要为肉类 小肠结肠炎耶尔森氏菌 猪肉、牛奶 * 为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。 ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。 温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。 保温的方式除有的ELISA仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴；若用保温箱，ELISA板应放在湿盒内， * 5.显色 洗涤决定着实验的成败。 目的：清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。 6 显色和比色 （1） 显色 OPD底物显色一般在室外或37℃反应20-30分钟 TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰 （2） 比色 比色结果的表达以往通用光密度（oplical density，OD），现按规定用吸光度（absorbence，A） （3） 酶标比色仪 * 第三节 放射免疫分析测定技术检测食品微生物 一、放射免疫分析技术定义及其发展 （一）定义 放射免疫分析技术（Radioimmunoassay，RIA）——凡是利用放射性同位素标记的抗原或抗体，通过免疫反应测定的技术，都可称为放射免疫技术 （二）发展 美国免疫学家Pressmen和Eisen于1950年首先使用放射性碘标记抗原来研究抗原-抗体免疫反应。 美国科学家Berson和女科学家 R.Yalow（美,1921~）1950’末创建了放射免疫测定法 （胰岛素）， 1977年获诺贝尔医学奖 * （三）特点 优点：操作简便、迅速、灵敏度高、准确可靠，重复性好，应用范围广泛，可用自动化仪器或计算机处理。 缺点：具有一定的危害性并造成环境污染；所需设备和仪器比较复杂；对抗原抗体纯度要求也十分严格。 检测方法 检测范围 生化、常规免疫 mg~μg（10-3 ~10-6 g） 荧光免疫、酶免疫 μg~ng（10-6 ~10-9 g） 放射免疫、发光免疫 ng~pg（10-9 ~10-12 g） PCR