定量PCR试验的关键因素TroubleShooting.pptVIP

Delta-delta Ct Delta-delta Ct QIAGEN 高灵敏度高特异性试剂盒有效避免非特异性扩增 HotStar Taq — 化学修饰的热启动酶 HotStar Taq plus — 5分钟快速热启动酶 特殊缓冲液体系 — 无需优化Mg2+,退火温度 常见标准品： 线性化的质粒DNA PCR纯化产物 基因组DNA cDNA 标准品稀释及保存注意事项： 母液保存，小管分装 避免反冻融 去离子水新鲜稀释 充分振荡后移液 定量PCR实验的关键因素四 标准品的设置 GAPDH Beta-actin beta-2-microglobulin (B2M) ribosomal protein L13a (RPL13A) PPIA (Cyclophilin) ubiquitin C (UBC) eukaryotic translation initiation factors 4A (eIF4A) 18S rRNA …… 定量PCR实验的关键因素五 内参照的选择 非特异扩增 Shortened cDNA 引物二聚体 定量PCR实验的关键因素 Trouble Shooting Sybr Green法 trouble shooting第一步： 熔解曲线分析 绝对定量 4-5个不同浓度的标准品 待测样品的Ct 落在标准品Ct范围之内 斜率一般在-3.3 ~ -3.8 斜率-