冬虫夏草通过诱导血红素加氧酶-1表达抑制肾小管间质纤维化-内科学(肾病)专业论文.pdf.docxVIP

2）4%多聚甲醛配制取40g多聚甲醛粉末，加入0.1MPBS(PH=7.2-7.4)900ml，加热至60℃，在搅拌的同时滴加1MNaOH 使溶液澄清，用ddH2O定容至1000ml，用滤纸过滤即可，4℃ 保存。3）二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒为过氧化物酶的显色剂之一。含有A、B、C三种显色试剂。临用时取蒸馏水1 毫升加试剂A、B、C各一滴混匀即可。现用现配。 4）30％丙烯酰胺凝胶储存液：将29g丙烯酰胺和1g N,N’-亚甲基丙烯酰胺溶于总体积为60ml的ddH2O中，加热至37℃溶解，补加ddH2O至终体积为100ml。 0.45μm微孔滤膜过滤除菌，检测该溶液pH值应不大于7.0，置棕色瓶内在4℃ 中避光保存备用。5）10％过硫酸铵AP：提供驱动丙烯酰胺和N,N’-亚甲基丙烯酰胺聚合所必需的自由基。取AP0.5g，加入去离子水5ml中搅拌溶解，分装成1ml/管，－20℃中保存，即用即取，解冻后置于4℃中保存，短期内使用。6）10％SDS：SDS10g，加入去离子水100ml，在37℃水浴中搅拌助溶，置于室温下保存备用。7）1.5mol/lTris-盐酸（pH8.8）：在300mlddH2O中溶解91gTris碱（1.5mol/L），用1mol/lHCl调节pH至8.8，补加ddH2O至体积500ml，置于4°C中保存备用。8）1mol/lTris-盐酸（pH6.8）：在40mlddH2O中溶解6.05gTris碱，用1mol/l HCl调节pH至6.8，补加ddH2O至体积100 ml，置于4°C中保存备用。9）5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液储存液：Tris15.1g、甘氨酸94g、SDS5.0g，加入去离子水800ml，搅拌溶解，定容至1L，置于室温下保存备用。 10）膜转移缓冲液：甘氨酸 2.9g、Tris5.8g、SDS0.37g，加入去离子水约600ml，充分搅拌溶解，定容至800ml，置于室温下保存备用。临用前加入甲醇200ml。 11）10×TBS：氯化钠40g、Tris 12.1g，加去离子水溶解，定容至500 ml，加浓盐酸调节pH至7.6，置于4°C中保存备用。12）1×TBST：10×TBS50ml，加去离子水定容至500ml，加Tween-200.25ml，置于4°C中保存备用。13）封闭液（5％脱脂奶粉）：5g脱脂奶粉加1×TBST至100ml，充分搅拌溶解，滤纸过滤，现配现用。2方法2.1实验动物及分组选择健康雄性清洁级SD大鼠72只，体重（200±10）克。随机分为4组：①假手术组（A组），②UUO模型组（B组），③UUO加冬虫夏草治疗组（C组），④ UUO加冬虫夏草和血红素加氧酶抑制剂卟啉锌（zinc(a)protoporphyrin η,ZnPP）治疗组（D组）。注:各组年龄、性别、体重各方面匹配，各组均18只。2.2实验方法UUO模型制作及取材各组大鼠以2％戊巴比妥钠按40 mg／kg腹腔注射麻醉后，将其固定于手术台上，去毛备皮并消毒腹部皮肤，行左侧腹部切口，逐层切开皮肤、肌肉及腹壁各层，沿左肾下极寻找到左输尿管，暴露并分离左侧输尿管，其中假手术组大鼠仅切开腹腔并游离左侧输尿管，但不予结扎和剪断，其他各组大鼠于输尿管中上1/3处用4号线上下结扎两处，然后在两道丝线结扎点间剪断输尿管，并逐层缝合。术后继续灌胃，方法同上，各组大鼠随机选取6只分别于输尿管结扎术后第3、7、14天断头处死，快速取出左肾，去掉包膜，按冠状位纵形剖开，取肾组织的1/2置于4%多聚甲醛固定液固定，另外1/2置于液氮中保存。2.2.2肾组织病理学检查（HE染色和Masson染色）①石蜡切片制作 1)组织固定、脱水、浸蜡、包埋：组织块约为7×5×2mm，置于4%多聚甲醛中，固定24小时后，于75%乙醇脱水30分钟两次、95%乙醇脱水20分钟两次、无水乙醇脱水10分钟。二甲苯脱乙醇3次，各30分钟。石蜡浸入3次，分别为30分钟、30分钟、1小时。石蜡冷却包埋。2)载玻片的处理：将载玻片放入硫酸洗液浸泡24小时以上，用流水冲洗干净硫酸洗液，95%乙醇浸泡24小时左右，蒸馏水洗5次，将载玻片整齐排好，放入烤箱中烤干。将洗净、干燥的玻片放入以纯丙酮1:150比例稀释的多聚赖氨酸(APES) 中停留1～2分钟，入蒸馏水洗去未结合的APES，取出低温(37℃)烤干。3)石蜡切片与贴片：用石蜡切片机固定蜡块，切片刀刃与蜡块上下缘平行，切成厚5μm的石蜡切片，切成的蜡片置于50℃温水浴中，用细尖镊将蜡片展开，附贴于玻片上，并置37℃恒温中过夜，以减少脱片。 4)烤片：石蜡切片放塑料架上，置于60℃烤箱内烤30分钟使石蜡切片牢固贴在载玻片上。 5)石蜡切片脱蜡至水：二甲苯脱石蜡三次各15分钟，无水乙醇浸入2次，各10分钟，95%乙醇