玉米芽再生过程中茎端分生组织的形成及生长素和细胞分裂素响应模式的研究-发育生物学专业论文.docx

2．1．3酶及生化试剂．252．2实验方法．252．2．1RNA的提取、纯化和反转录252．2．1．1Trizol法提取总RNA．．252．2．1．2RNA的纯化262．2．1．3转录cDNA第一链的合成．272．2．2表达载体的构建及玉米遗传转化．272．2．2．1PCR扩增目的片段．272．2．2．2目的片段与克隆载体的连接。272．2．2。3大肠杆菌感受态细胞的制备一282．2．2．4大肠杆菌感受态细胞的转化(热击法)．．282．2。2．5碱法小量质粒DNA的提取292．2．2．6目的片段和质粒DNA的酶切与回收292．2．2．7组成型artificialmicroRNA沉默目的基因表达载体的构建292．2．2．8LBA4404农杆菌感受态制备．322．2．2．9农杆菌感受态细胞的转化(电击法)．．322．2．2．10农杆菌介导的玉米幼胚遗传转化及抗性植株的获得332．2．3扫描电子显微镜观察．332．2．4原位杂交分析．342．2．4．1材料的固定．．342．2．4．2材料的包埋．．342．2．4．3切片352．2．4．4探针标记．．352．2．4．5消化、乙酰化和杂交．．382．2．4．6洗片392．2．4．7检测392．2，5共聚焦显微镜观察和图像处理。403结果与分析413．1玉米离体芽再生体系的建立及形态学观察413．1．1玉米芽再生体系的建立．41万方数据3．1．2玉米离体芽再生的形态学观察．413．2玉米茎端分生组织特异表达基因ZmWUSl的功能分析423．2．1ZmWUSl基因过表达及artificial载体的构建和遗传转化．423．2．1．1ZmWUSl基因artificialmicroRNAs载体及过表达载体的构建。433．2．1．2农杆菌介导ZmWUSl表达载体的转化及再生植株的获得．443．2．2ZmWUSl转基因植株的表型分析．453．3玉米茎端分生组织特异表达基因ZmWUSl和KNl在离体芽再生中的表达．473．3．1锄删的表达模式分析．．473．3．2KNl的表达模式分析．493．4激素在玉米离体芽再生中的作用503．4．1生长素在离体芽再生中的响应模式及极性运输．503．4．2细胞分裂素在离体芽再生中的响应模式．514讨论535结j．沦56参考文献57致谢65附录一66万方数据山东农业大学硕士学位论文中文摘要玉米芽的再生是获得转基因植株的基础。到目前为止，人们已经从幼胚、玉米悬浮细胞、幼茎、茎尖、叶片、成熟胚等多种外植体中培养得NT愈伤组织，并最终获得了再生芽。离体芽的再生过程需要愈伤组织中特异的激素区域性响应调控，在拟南芥离体芽再生中，生长素分布在芽起始位点周围，细胞分裂素分布在中心，共同调控离体芽的再生。与此同时，茎端分生组织特异基因WUSCHEL(WUS)和CLAVATA3(CLV3)的表达，标志着茎端分生组织在拟南芥离体芽再生过程中重新形成。玉米作为单子叶植物，芽再生的具体分子机理尚不清楚。本研究首先分析了玉米茎端分生组织特异表达基因ZmWUSCHELl(Z加删)的生物学功能，证明该基因能影响茎端分生组织的发育。通过观察ZmWUSl和另一个茎端分生组织关键调控基因KNOTTEDl(圈W)在玉米芽再生过程中的表达模式，发现ZmWUSl和KNl在胚性愈伤组织中区域性的诱导表达，标志着茎端分生组织诱导形成；还分析了生长素和细胞分裂素的响应模式，并与拟南芥芽再生过程中的响应模式进行比较，发现生长素和细胞分裂素响应信号呈现单子叶植物特异的极性分布模式，共同调控茎端分生组织的起始。该研究为单子叶植物芽再生机理的研究提供了信息。具体研究结果如下：(1)以玉米幼胚为外植体诱导离体芽再生的形态学观察。玉米离体芽的产生首先需要诱导愈伤组织的形成，这个过程是在外源生长素的作用下完成的。除去外源生长素，在愈伤组织表面形成突起状的茎端分生组织，然后在茎端分生组织侧面产生幼叶原基，最终形成完整的植株。(2)ZmWUSl的功能分析。通过分析ZmWUSl过表达植株的表型，我们发现相对于野生型植株，过表达转基因植株发育较快、节间变短、叶片密度略有增加，并且有些株系的叶序由互生变为对生。而抑制ZmWUSl的表达则导致植株生长发育变缓。实验结果证明ZmWUSl是调控玉米茎端分生组织发育的关键因子。(3)ZmWUSl和KNl在离体芽再生中的表达分析。为研究离体芽再生中茎端分生组织的形成，我们分析了分生组织关键调控基因ZmWUSl和KNl在芽诱导过程中的表达模式。结果显示，在芽诱导早期胚性愈伤组织表层以下4．6层细胞中首先检测到ZmWUSl基因的表达。这些细胞与周围的愈伤组织细胞不同，体积较小且排列紧密，具有茎端分生组织干细胞的特征。这些细胞随后发育成离体芽。我们也观察到KNl具有万方数据玉米芽再生过程中茎端分生组织的建立