基因组文库构建.pptVIP

三. 应用寡核苷酸探针来分离目的基因 1.寡核苷酸探针的来源 (1)从某一物种分离到的基因序列可作为另一物种的核酸探针； (2)由蛋白质保守区中相邻的6～7个氨基酸推导合成出核酸探针。 合成探针时必须考虑到： ①探针的特异性； ②碱基的简并性。 * 四.假阳性克隆的克服 应用混合探针分离克隆基因虽取得了良好的效果，但也会产生相当数量的假阳性。克服假阳性的方法有二: (1)制备“ 猜测体(guessmer)” 探针 猜测体 探针是根据特定物种某已知蛋白的密码子使用频率，选择含有密码子简并程度最低的蛋白质区段进行人工合成的低简并性寡核苷酸探针。 * * 猜测体探针只要有85％的 碱基能和目的基因配对即可杂交。如连续的配对区较长(达10～12Nt),那么猜测体探针作用的强度足以鉴定出含目的基因的阳性克隆。 如错配的核苷酸均匀分散在探针分子的各部位，那么这种猜测体探针就不会和目的基因的序列杂交。 提高杂交温度，以减少假阳性。 * (2)PCR猜测体技术 ①测定尿酸氧化酶末端一段32aa的序列； ②根据此段顺序两侧的序列推测,合成一组引物； ③从猪肝中提取mRNA,反转录成cDNA,用以上 述引物对此cDNA进行特异扩增。 ④扩增产物连接到载体上进行克隆，并用唯一猜 测体探针进行杂交，选择阳性克隆。此猜测体