体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向子宫韧带成纤维细胞分化的研究-妇产科学专业论文.docx

摘耍充质干细胞与肌腱或韧带成纤维细胞共培养后可提高兔肌腱、韧带相关基因的表达。骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)是一种具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，在体内、外均可定向诱导分化为具有各种表型的子代细胞。本研究旨在研究体外正常细胞及机械牵张损伤细胞在共培养体系中定向诱导BMSCs分化为子宫韧带成纤维细胞的影响。实验中用机械牵张刺激损伤体外培养的大鼠子宫韧带成纤维细胞，造成PFD的细胞损伤模型，将BMSCs与.TH常子宫韧带成纤维细胞和机械牵张损伤的子宫韧带成纤维细胞在体外间接共培养（非接触式）。同时，检测共培养诱导后BMSCs弹性蛋白、赖氨酰氧化酶(lysyloxidase,LOX)、Fibulin-5的表达情况，以进一歩认i只BMSCs的分化潜能及生物学特性。本文研究了在体外通过非接触式共培养诱导BMSCs向子宫韧带成纤维细胞的分化，为从组织工程学角度以根源上治疗PFD疾病提供可能的研究思路及新的治疗手段。研究方法1.大鼠BM SC s的体外分离培养：采用密度梯度离心法结合传代贴壁筛选法分离纯化获得大鼠BM SCs;通过形态学观察、细胞生长曲线绘制、细胞表面特异抗原及细胞周期的流式细胞学检测，对体外培养获得的BM SCs进行初歩鉴定；采用体外诱导大鼠BM SCs向成骨细胞和成脂细胞的分化，对获得的BM SCs的生物学功能进行鉴定。2.大鼠子宫韧带成纤维细胞的体外分离培养及鉴定：采用大鼠子宫韧带组织块酶消化法，进行子宫韧带成纤维细胞的原代培养，通过形态学观察、细胞生长曲线的绘制及免疫组化测定其胶原i、m蛋白的表达对获得的子宫轫带成纤维细胞迸行鉴定。3.对大鼠子宫韧带成纤维细胞进行体外机械牵张，建立机械牵张损伤模型：根据韧带成纤维细胞的生物学特性，在细胞牵张仪上采用负载10%应力，1赫兹的机械牵张刺激大鼠子宫韧带成纤维细胞3h、6h、12h、24h,36h不同时间段后，通过透射电镜、鬼笔环肽染色观察不同吋问牵张损伤后成纤维细胞的超微结构和细胞骨架的变化情况；采用实时定量RT-PCR技术测定不同吋问牵张损伤后成纤维细胞1型胶原和III型胶原的合成能力；用台盼蓝染色观察细胞的凋II摘耍亡情况。4.大鼠BMSCs与大鼠子宫韧带成纤维细胞共培养体系的建立：将大鼠BMSCs与JH常及不同牵张时间后的大鼠子宫韧带成纤维细胞间接共培养3、6、12天，采用实时定量RT-PCR检测BM SCs中弹性蛋白、LOX及Fibulin-5mRNA的表达情况；采用免疫蛋白印记法（western-blot)检测BMSCs中弹性蛋白、LOX及Fibulin-5蛋白的合成情况。应用SPSS16.0 软件包进行数据处理。所有数据结果均采用平均数士标准差(%±s)表示。用one-wayANOVA检验样本与对照组的组间差异，以a=0.05作为检验水准。实验结果1.体外获得的大鼠骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs),其细胞形态均一，呈梭形、扁平形，增殖至细胞融合时，细胞为典型的长梭形，呈集落样或放射状排列，有一定的极性；检测第四代大鼠BMSCs表面特异抗原分子，99.0%以上细胞C D90表达阳性，98.8% 以上的细胞CD44表达阳性，CD34、CD45均表达阴性，分别为1.8%和3.7% ;细胞周期结果显示：第4代 BMSCs处于G0/G1期的细胞约为80% 以上，表明大多数细胞处于静止期；细胞生长曲线典型，且所得细胞可被诱导为成骨和成脂细胞，符合间充质干细胞的特征。2.体外成功获得子宫韧带成纤维细胞，细胞贴壁生长，形态呈梭形，与典型的成纤维细胞形态相似；细胞生长曲线典型，免疫组化测定其胶原I、III型蛋白的表达均符合韧带成纤维细胞特征。3.本实验以1Hz的强度，负载10%牵张刺激细胞，用荧光物质（鬼笔环肽和DAPI)分别对所得细胞内F-actin和细胞核进行特异性标记，结果提示：F-actin在机械牵张下发生了解聚和重排。力学牵张短时间内子宫韧带成纤维细胞未出现明显变化，长时间刺激后细胞变狭长，排列无序，超微结构出现损伤，甚至出现凋亡。4.对大鼠子宫韧带成纤维细胞中胶原I和胶原IIImRNA的表达量进行检测，结果表明：牵张刺激3h、6h、12h后，胶原mRNA的表达量随牵张时间逐渐增多，牵张刺激24h、36h后，胶原mRNA的表达量随牵张时间逐渐降低，其中牵III摘耍张刺激12h大鼠子宫韧带成纤维细胞中胶原m RNA的表达量最多。同吋，与对照组（未受牵张刺激的正常成纤维细胞）相比，牵张刺激3h、6h、12h、24h，胶原m RNA的表达量均增加；而牵张刺激36h,胶原m RNA的表达量较对照组降低。5.通过实时定量RT-PCR 和免疫蛋白印记法