核技术应用09.ppt

??? ２．Northern 印迹转移杂交法 　　　该法为检测RNA的方法，与Southern 印迹转移杂交法在操作上基本无差别。 基本程序： 提取RNA或mRNA ---→在强变性剂下进行琼脂糖电泳---→ 将分离开的RNA转移到硝酸纤维素膜上---→ 以核素标记的探针进行杂交---→ 放射自显影---→根据X光片上的条带了解与探针互补的RNA的大小及数量（在基因重组研究中此方法可用于确定外源基因的表达情况，检测是否形成了mRNA）。 3．斑点杂交 是将待测定的核酸样品和核素标记的杂交探针同时溶于杂交液中进行的反应。 液相杂交时，常利用层析柱，将双链DNA吸附在柱中的吸附剂上，经过改变溶液的成分或离子强度等，再将其洗脱下来，分析进行放射性测量。 液相杂交的具体方法主要包括： （1）核素标记的DNA探针同RNA的杂交； （2）核素标记RNA探针同DNA的杂交； （3）标记DNA与非标记DNA的杂交； （4）核酸酶S1保护分析法。 * * 主 讲 内 容 §９.2 DNA和RNA的放射性核素标记 第九章　核技术在生物技术中 　　　　　　的应用 §９.1　核酸的分子杂交 §９.３ DNA分子标记及其应用 § ９.1　核酸的分子杂交 一、原理 　　　　DNA双螺旋结构，当加热或在尿素作用下引起变性时，其双链可分开为两条互补的单链。但变性DNA在一定条件下又可复性，使两单链按碱基配对原则自动重新结合成双螺旋结构。 若两条单链DNA来自不同的物种或品系，只要它们的碱基序列是同源的或部分地同源，就能发生全部或部分地复制，该称为核酸分子杂交。 　　 两核酸分子杂交时，要求分子之一为已知且用放射性核素标记，该标记分子称为“探针”（probe）。也即探针为已知基因的DNA片段，以此来识别另一种核酸分子与其同源的部分。 原位杂交 固相杂交 液相杂交 二　基本类型 指先将待测核酸样品结合在某固相支持物上，再与溶液中的核素标记探针进行杂交，故又称膜上印迹杂交。 1．Southern印迹转移杂交 （1975年由Southern E。M首创，并由此而命名） 方法：经电泳分离后的DNA琼脂糖凝胶板显色并拍照---→ 胶板上DNA变性解链---→吸印转移到硝酸纤维素膜上固定--→预杂交数小时---→用含有标记探针的杂交溶液进行杂交---→烘干---→放射自显影---→Ｘ光片上显示出与探针的核苷酸序列具同源性的DNA限制性片段。 硝酸纤维素膜上其它所有DNA片段，因与探针DNA无源性，故不能杂交，也不能与底片感光。一般认为参与杂交双方的核酸片段至少要有２０个以上的碱基顺序是互补的，才能发生较为稳定的杂交。 　 （一）固相杂交 固相杂交 ３. Western 印迹转移杂交法 是用于检测蛋白质的方法,也与Southern印迹转移杂交法基本相同，但蛋白质检测采用酶联免疫分析，也采用125I放射性核素标记的蛋白质，随后进行放射免疫分析。 基本操作： 提取、纯化蛋白质---→用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质---→将其转移到硝酸纤维素膜上---→将蛋白质作为抗原进行免疫程序测定。 该法主要用于检测外源基因在转化细胞中的表达情况，即是否产生了外源基因新编码的蛋白质。 固相杂交 核酸原位杂交：是指用特定标记的已知顺序核酸与检测对象中的核酸 进行杂交并对其实行检测。 可分为三类：原位菌落杂交、细胞或染色体上的原位杂交、原位斑点杂交。 （二）原位杂交 1。原位菌落杂交 指在构建基因组文库或cDNA文库时，长在培养皿上的菌落或噬菌斑经转移到硝酸纤维素膜上，再进行的分子杂交。 复植法将所有菌落分别在两个相同培养皿中按顺序植入（其中一个培养皿为对照） ---→对膜上的细菌进行裂解变性---→杂交（使单链DNA在膜上与放射性核素标记的RNA或DNA探针杂交） ---→洗去膜上未杂交的探针---→进行放射性自显影，与探针有同源性的DNA印迹将会显现在X光片上---→分析（从保存的对照盘上，采下相对位置的菌落，培养并提取其中重组质粒，就可得到欲研究的DNA序列）。 2．细胞或染色体上的原位杂交 这是用3H或35S标记的DNA和RNA探针与细胞学制片上的细胞核、染色体的DNA杂交，通过放射自显影技术追踪具有特殊序列的DNA的定位，从而找出此DNA序列在染色体上的定位关系。 这是将核酸分子杂交技术、显微技术与微观放射自显影技术相结合，在显微和亚显微结构水平上研究某些基