小标本和细胞学标本的基因检测(病理科) ppt课件.ppt

* * * * * * * Gefitinib * * * * * * * 小标本和细胞学标本的 基因检测 上海市胸科医院 病理科 内容介绍 小标本和细胞学标本的获取 标本的病理学评估 检测方法的选择 EGFR突变检测应用 * 小标本和细胞学标本的获取 * 内科多手段获取肺癌标本 病理诊断+基因检测 * 支气管镜活检 标本较小 通常是福尔马林固定、石蜡包埋处理 建议采用灵敏度高的检测方法 * 细针穿刺活检 标本较小 通常是福尔马林固定、石蜡包埋处理 建议采用灵敏度高的检测方法 * 细胞学标本 细胞学标本中通常肿瘤细胞数目较少，需要采用灵敏度高的检测方法 利用染色后的细胞涂片直接刮片，提取DNA，用于基因检测 制备细胞蜡块： 处理流程：细胞学标本经离心处理后，常规福尔马林固定、处理及石蜡包埋 制备细胞蜡块的好处： （1）便于长期保存；（2）方便用于EGFR基因突变的检测及其他分子生物学标记物的检测 胸水或支气管刷片 涂片、染色 病理诊断 液基细胞学 病理诊断 细胞蜡块，切片染色 病理诊断 * 病理组织学诊断：确保肿瘤组织是非小细胞性肺癌 肿瘤量：确保有足够的肿瘤组织用于突变检测 尽量保证200-400个肿瘤细胞 可以尝试进行200个肿瘤细胞的标本检测 5uM 10张切片能满足突变检测需求 当细胞数较少时,可以适当增加切片数 肿瘤比例：一般要求肿瘤比例20%，否则，需要标识肿瘤丰富的区域，提高肿瘤细胞比例 尽量去除非肿瘤组织及细胞，提高检测的敏感性 不同敏感性的检测方法对肿瘤比例要求不一样 标本的病理评估 * 小标本和细胞学标本的 EGFR突变检测 * 肿瘤组织的异质性 遗传异质性 正常细胞混杂 * 检测方法的比较 ME-PCR/ Sequencing O = Transfer product /add reagent/ open tube PCR: Real-timeDetection PCR Clean-up Sequencing Rxn Capillary Sequencing PCR PCR Clean-up Sequencing Rxn Capillary Sequencing PCR Hetero-duplex Capillary Electro- phoresis ARMS PNA-LNA clamp PCR/ Sequencing Nested PCR/ Sequencing PCR/HRMA/dHPLC PCR/RFLP PCR RFLP Electro- phoresis Sizing PCR PCR Clean-up Sequencing Rxn Capillary Sequencing RFLP O O O O O O O O O O O O TaqMan Clean-up O Clean-up O Clean-up O O O O PCR SURVEYOR cleavage dHPLC Sizing O Confirmation by sequencing PCR/SURVEYOR PCR Clean-up Pyro- sequencing Rxn Pyro Sequencing O O 1 2 3 4 5 6 Steps 7 Confirmation by sequencing O Confirmation by sequencing O O O 1% ~10% 3-10% 10% 3-12% 20~30% 20~30% PCR: Real-timeDetection ~10% 1% * 1. F Hirsch, et al. JCO 2006；2. C Zhu, et al. JCO 2008 3. T Mok, et al. Discovery Med 2009 ISEL Biomarker 测序法阴性样本（～200） ARMS法重新检测 17(+) 测序法复测 7(+) BR21后续分析 测序法阴性样本（n=148） ARMS法重新检测 11(+) 测序法与ARMS法应用 * 测序法与ARMS法应用实例-2 J Clin Oncol. 2011, 20;29:3316-3321. ARMS法比测序法更灵敏，灵敏度为1% * 国际肺癌协会专家共识 * 小标本和细胞学标本的 EGFR突变检测应用 * 支气管刮取物样本检测肿瘤EGFR突变 British Journal of Cancer,2006, 95:1070-1075 支气管刮取物样本可以进行EGFR突变检测 * J Clin Oncol 30, 2012 (suppl; abstr e21103) EBUS-TBNA 样本检测肿瘤EGFR突变 样