如何提高PCR产物克隆的效率把PCR产物克隆到载体上-中国试剂网.PDFVIP

中国试剂网 3.12.7.56 如何提高 PCR 产物克隆的效率 把 PCR 产物克隆到载体上常见有 3 种做法： 1.直接克隆到 T 载体（或者 U 载体上） 2.引物设计时引入酶切位点，PCR 产物酶切后直接克隆到目标载体上 3.将平末端 PCR 产物直接克隆到平末端酶切载体上。 方法 3 主要是针对高保真的聚合酶比如 Stratagene 公司的Pfu 酶，New England Biolabs 公司的 Vent 酶，以及QIAGEN 公司新出的同时具有热启动功能的高保真 ProofStart 酶，进行 PCR 扩增，由于这类酶有很强的校读功能，能够以模版为准 切掉错配的碱基，因而得到的 PCR 产物多数是平末端，不能用 T 载体克隆。通 常需用目的载体多克隆位点上的平末端单酶切位点，单酶切得到平末端的线性片 断，直接连接 PCR 产物。这类酶得到的产物通常不能用 TA 克隆试剂盒。目前 也有商业化的平末端 PCR 产物克隆试剂盒，不过较少用。平末端的连接效率低， 通常需要高浓度的连接酶，较长的连接时间，合适的片断：载体比例，有的时候 还需要调整反应体系的 ATP 浓度或者增加聚乙二醇（PEG2000 ），以得到较高的 连接效率。许多厂家都有推出快速连接试剂盒，比如 New England Biolabs 新出 的 5 分钟快速连接试剂盒，能够简化平端连接步骤和条件，缩短连接时间，提高 连接效率。 不过需要注意的是一些厂家（例如 Clontech、Gibco/BRL、Roche ）也生产一 些用于 PCR 的高保真混合酶，是采用常规 Taq 酶和一些有校读功能的 （proofreading ）的聚合酶按比例混合（这样得到的混合酶的保真性比普通 Taq 酶高一点，但通常不如 Pfu 、ProofStart 等酶），因而得到的PCR 产物也是平端和 A 末端的混合产物，是否能用 TA 克隆试剂盒需要参考厂家的说明。 方法 2 是比较常用的经济的方法，不需要购买 T 载体，可以直接通过酶切 PCR 产物，得到粘末端，直接连接到目的载体上。在顺的时候，这种方法是非常简单 的。可有时候也会出问题，双酶切就是连不上，比较常见的原因是 PCR 产物双 酶切不完全，比如没有纯化产物就直接双酶切，有的酶比较“娇气”容易出现“切 不动”或者是“星号活力”，得不到正常的粘末端而连不上。有时是因为选定的两 种酶反应条件相差比较大，为了省事同时双酶切（通用 Buffer 不是一定通用的， 不能过分迷信，有时会成为莫名其妙出错的根源），也会出现类似的错误。还有 中国试剂网 3.12.7.56 一种情况是由于有些酶在酶切时需要一定的“ 占位空间”，也就是要求酶切识别序 列的前后有一定数量的碱基才能正常酶切，而设计引物时酶切位点直接就在 5 末端，没有留下足够的保护碱基而导致 PCR 产物酶切不动，无法正常的克隆。 由于这些错误很难检查，有的时候会浪费大量的时间，还是莫名其妙没有结果。 由于常见的Taq 酶或者没有校读功能的 DNA 聚合酶（即不是高保真）在 PCR 扩增的时候通常会在 PCR 产物末端多添加一个 A （即增加一个模版上不存在的 A ）。这个突出的A 成为 PCR 产物 TA 克隆技术的基础。带有互补的突出 T 末端 的线性载体能够有效提高 PCR 产物的克隆效率，解决方法 2 遇到的难题，所以 方法 1 也是目前比较常见的方法。 TA 克隆在顺的时候也很简单，简直就是“a piece of cake”，不用考虑酶切位点， 引物设计等等问题，好的载体克隆效率高、重组率高而且两端有丰富的单酶切位 点便于后继的克隆，但是烦的时候也会出现无缘无故克隆不上或者重组率很低的 问题。比较容易忽略的问题是用高保真的酶进行 PCR 扩增，应该选用平端克隆 载体而错用了 TA 载体。常见但很难解决的问题则是由于 T 末端容易和其他碱基 错配而导致自身环化或者克隆了引物/ 自身褪火引物二聚体或者 PCR 不完整产 物，因而出现假阳性。因而 QIAGEN