生物素亲和素标记技术.PPT

生物素、亲和素标记技术 广州医学院第一附属医院检验科 廖伟娇 一、生物素及其理化性质 1 概念 2 分子式 结构特点 溶解特性 等电点 其它特性 1 概念： 生物素(biotin)是动、植物体内广泛分布的一种小分子生长因子，又名辅酶R或维生素H。 分子式： C10H16O3N2S 分子量：244.31 结构特点： 咪唑酮环/四氢噻吩环 结合亲和素 侧链末端羧基结合蛋白质 溶解特性： 难溶于水，易溶于二甲基甲酰胺(DMF) 等电点： PH=3.5 其它特性： 羧基需经活化修饰才能结合蛋白质 （羧基活化的生物素，称为活化生物素，也叫生物素衍生物） 生物素衍生物的种类及特性： 1 生物素羟丁酰亚胺酯(BNHS)： DMF 制备：生物素 + N-羟基琥珀酰亚胺 二环己基碳二亚胺 标记特点： BNHS中的羧基与蛋白质中的赖氨酸氨基 结合达到标记的目的 适用于：标记Ab、酶、中性或偏碱性Ag、DNA 长臂活化生物素(BCNHS)： DMF + 6-氨基己酸 制备：生物素 + N-羟基琥珀酰亚胺 二环己基碳二亚胺 (在BNHS的B与羧基之间插入2分子的6-氨基己酸 ） 标记特点: (同BNHS) BCNHS中的羧基与蛋白质中的赖氨酸氨基结合达到标记的目的 适用：(同BNHS) 标记Ab、酶、中性或偏碱 性的Ag、DNA 3 生物素酰肼(BHZ)： 制备：生物素 +水合肼 标记特点： BHZ与蛋白质中的醛基结合而标记 适用：标记偏酸性的蛋白质、酶、DNA 三、亲和素及其理化性质 1 概念 2 分子式 结构特点 溶解特性 等电点 其它特性 1 概念： 亲和素(avidin)：是动物微生物中提取的一种含10%碳水化合物的碱性糖蛋白。 链霉亲和素：是从链球菌属的菌培养液中提取的一种蛋白质 分子量： A: 6.7KD SA: 6~6.5KD 3 结构特点： 每分子由四个亚基组成 溶解特性：溶于水，C=5mg/ml 等电点： A: PH=10.5 SA: PH= 6.0 比活性： A≥12u/mgP SA ≥14u/mgP 四、亲和素的活性及其测定 1 亲和素的活性：是表示亲和素结合生物素的能力，即：ugB/mgA或ugB/mgSA。 活性测定： ⑴ 羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)法： A(SA) + HABA（红色） B A-B （出现黄色时B的量） ⑵ 分光光度法： 五、生物素标记物及亲和素标记物的制备： 1 生物素标记物的制备： B +Ab/Ag/E 交联剂 B-Ab/Ag/E 亲和素标记物的制备： A/SA+ Ab/Ag/ E 交联剂 A/SA-Ab/Ag/E 六、技术类型： 可有Ag与Ab反应的各种免疫方法：夹心法、间接法、竞争法等，在次基础上引入A-B系统。 BAB法： Ag+B·Ab Ag-Ab·B A Ag-Ab·B-A B·E Ag-Ab·B-A-B·E 特点：以游离A分别连接B-Ab和B-E BA法： Ag+B·Ab Ag-Ab·B A·E Ag-Ab·B-A-B·E 特点：以A-E/SA-E代替BAB法中的A，省 却了加B-E的步骤 ABC法： ⑴ A+B·E A- B·E----------ABC ⑵ Ag+B·Ab Ag-Ab·B ABC Ag-Ab·B-ABC