基因多态性的检测方法多态性-中国试剂网.PDFVIP

中国试剂网 3.17.2.1 3.17.2.1 基因多态性的检测方法 多态性（polymorphism ）是指处于随机婚配的群体中，同一基因位点可存在2 种 以上的基因型。在人群中，个体间基因的核苷酸序列存在着差异性称为基因 （DNA ）的多态性(gene polymorphism) 。这种多态性可以分为两类，即DNA 位 点多态性(site polymorphism)和长度多态性 (longth polymorphism) 。 基因多态性的主要检测方法简述如下： 1．限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP ）： 由DNA 的多态性，致使DNA 分子的限制酶切位点及数目发生改变，用限制酶 切割基因组时，　　　钠　问　亢兔扛銎　蔚某ざ染筒煌　　此　降南拗菩云　 纬ざ榷嗵　裕　贾孪拗破　纬ざ确⑸　谋涞拿盖形坏悖　殖莆　嗵　晕坏恪Ｗ 钤缡怯肧outhern Blot/RFLP 方法检测，后来采用聚合酶链反应（PCR ）与限制酶 酶切相结合的方法。现在多采用 PCR-RFLP 法进行研究基因的限制性片段长度 多态性。 2 ．单链构象多态性（SSCP）：是一种基于单链DNA 构象差别的点突变检测方法。 相同长度的单链DNA 如果顺序不同，甚至单个碱基不同，就会形成不同的构象。 在电泳时泳动的速度不同。将PCR 产物经变性后，进行单链DNA 凝胶电泳时， 靶DNA 中若发生单个碱基替换等改变时，就会出现泳动变位（mobility shift ）， 多用于鉴定是否存在突变及诊断未知突变。 3 ．PCR-ASO 探针法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO ）：即等位基因特 异性寡核苷酸探针法。在PCR 扩增DNA 片段后，直接与相应的寡核苷酸探杂交， 即可明确诊断是否有突变及突变是纯合子还是杂合子。其原理是：用PCR 扩增 后，产物进行斑点杂交或狭缝杂交，针对每种突变分别合成一对寡核苷酸片段作 为探针，其中一个具有正常序列，另一个则具有突变碱基。突变碱基及对应的正 常碱 基匀位于寡核苷酸片段的中央，严格控制杂交及洗脱条件，使只有与探针 序列完全互补的等位基因片段才显示杂交信号，而与探针中央碱基不同的等位基 因片段不显示杂交信号，如果正常和突变探针都可杂交，说明突变基因是杂合子， 3.17.2.1 如只有突变探针可以杂交，说明突变基因为纯合子，若不能与含有突变序列的寡 核苷探针杂交，但能与相应的正常的寡核苷探针杂交，则表示受检者不存在这种 突变基因。若与已知的突变基因的寡核苷探针匀不能杂交，提示可能为一种新的 突变类型。 4. PCR-SSO 法：SSO 技术即是顺序特异寡核苷酸法（Sequence Specific Oligonucleotide, SSO ）。原理是PCR 基因片段扩增后利用序列特异性寡核苷酸探 针，通过杂交的方法进行扩增片段的分析鉴定。探针与 PCR 产物在一定条件下 杂交具有高度的特异性，严格遵循碱基互补的原则。探针可用放射性同位素标记， 通过放射自显影的方法检测，也可以用非放射性标记如地高辛、生物素、过氧化 物酶等进行相应的标记物检测。 5. PCR-SSP 法：序列特异性引物分析即根据各等位基因的核苷酸序列，设计出 一套针对每一等位基因特异性的（allele-specific ）、或组特异性 (group-specific) 的引物，此即为序列特异性引物（SSP）。SSP 只能与某一等位基因特异性片段的 碱基序列互补性结合，通过 PCR 特异性地扩增该基因片段，从而达到分析基因 多态性的目的。 6. PCR-荧光法：用荧光标记PCR 引物的5’端，荧光染料FAM 和JOE 呈绿色荧 光，TAMRA 呈红色荧光，COUM 呈兰色荧光，不同荧光标记的多种引物同时 参加反应，PCR 扩增待检测的DNA ，合成的产物分别带有引物5’端的染料，很 容易发现目的基因存在与否。 7. PCR-DNA 测序：是诊断未知突变基因最直接的方法，由于P