96孔板基因筛选方法.docVIP

96孔板基因筛选方法 一:构建基因文库 二:设计特异性引物 三:96孔板基因筛选 1. 实验前准备: 高压灭菌(12连孔PCR小管--插在96孔黄色板上构成所需96孔板, 离心管250ul, 500ul, 1000ul各灭菌若干瓶, 枪头各种型号各灭菌若干盒. 固体.液体.上层培养基共1L, 液体培养基以25ml分装20瓶, 上层培养基按50ml加0.25g琼脂粉分装2瓶, 剩余作为固体培养基按100ml加1.5g琼脂粉分装. 配1M MgSO4. 20%麦芽糖各100ul 然后抽滤后用1.5ml离心管分装. 无菌水(可用娃哈哈纯净水替代)用1.5ml离心管分装后, 装瓶高压灭菌. 再灭一瓶无菌水. 2. 培养XL-Blue E.coli, 大肠杆菌 取一瓶灭菌过的液体培养基, 按25ml体系, 加入25ul tet抗生素(50mg/ml), 再加入250ul 1M MgSO4, 250ul 20%麦芽糖, 用接种针挑单克隆菌落于培养基中. 置于37℃摇床150转速过夜. 3. 做第一批96孔板 3.1 取1至多ul (确保含有该基因)所克隆基因的cDNA文库, 加上400ul 培养的XL-Blue大肠杆菌, 37℃静止30min 3.2 将96孔底板放置于超净台上, 再将12连孔PCR小管, 插在该底板上做成所需的96孔板. 取一瓶灭菌的液体培养基(加入25ul tet抗生素, 250ul 1M MgSO4, 250ul 20%麦芽糖), 以150ul分装到96孔板每个孔中. 3.3 30min后, 将第一步的混液按4ul 分装到96孔板每个孔中. 用保鲜膜包好96孔板, 然后置于37℃摇床上200rpm培养8-10h. 3.4 做PCR检测 共3 次PCR 3.4.1 每行做PCR找到含有该基因的具体某一行 做8行PCR: 将每一行的12孔, 每孔各取5-10ul混匀. 这样做8行的各行的混液, 取这些混液1-2ul 做PCR. 电泳检测后发现哪孔有目标条带, 就表示相对应的那行有我们所要克隆的基因 3.4.2 以上步找到的含有目标基因的行, 对该行12孔每孔做PCR检测找到阳性单孔 3.4.3 做浓度梯度PCR 取10-20ul 阳性孔的菌液, 混匀后取1ul+ 99ul纯净水稀释100倍, 再取稀释100倍的混液10ul + 90ul 纯净水后就是稀释1000倍, 以此类推可以稀释10000倍. 取稀释100倍的混液, 1ul, 3ul ,5ul PCR 取稀释1000倍的混液, 1ul, 3ul ,5ul PCR 取稀释10000倍的混液, 1ul, 3ul ,5ul PCR 找到最低能够PCR检测出该基因的浓度 4. 做第二批96孔板 4.1 取1ul上步的最低浓度, 加上400ul 培养的XL-Blue大肠杆菌, 37℃静止30min 4.2 将96孔底板放置于超净台上, 再将12连孔PCR小管, 插在该底板上做成所需的96孔板. 取一瓶灭菌的液体培养基(加入25ul tet抗生素, 250ul 1M MgSO4, 250ul 20%麦芽糖), 以150ul分装到96孔板每个孔中. 4.3 30min后, 将第一步的混液按4ul 分装到96孔板每个孔中. 用保鲜膜包好96孔板, 然后置于37℃摇床上200转培养8-10h. 4.4 做PCR检测 共3 次PCR 4.4.1 每行PCR找到含有该基因的具体某一行 做8行PCR: 将每一行的12孔,每孔各取5-10ul振荡混匀. 这样做8行的各行的混液, 取这些混液1-2ul 做PCR. 电泳检测后发现哪孔有目标条带, 就表示相对应的那行有我们所要克隆的基因 4.4.2 以上步找到的含有目标基因的行, 对该行12孔每孔做PCR检测找到阳性单孔 4.4.3 做浓度梯度PCR 取10-20ul 阳性孔的菌液, 混匀后取1ul+ 99ul纯净水稀释100倍, 再取稀释100倍的混液10ul + 90ul 纯净水后就是稀释1000倍, 以此类推可以稀释10000倍. 取稀释100倍的混液, 1ul, 3ul ,5ul PCR 取稀释1000倍的混液, 1ul, 3ul ,5ul PCR 取稀释10000倍的混液, 1ul, 3ul ,5ul PCR 找到最低能够PCR检测出该基因的浓度 5. 重复做第二批96孔板的方法 6. 取第5步找到的阳性孔, 进行铺板长出噬菌斑, 挑单个噬菌斑检测出阳性噬菌斑 6.1 培养XL-Blue大肠杆菌过夜 6.2 取10-20ul 阳性孔的菌液振荡混匀后, 先稀释100倍, 再稀释1000倍, 10000倍. 6.3 在2灭菌过的1.5