多态性及基因测序分析方法研究苯丙酮尿症患者基因突变.docVIP

多态性及基因测序分析方法研究苯丙酮尿症患者的基因突变 　　摘 要 应用聚合酶链反应?单链构象多态性分析及基因测序的方法，分析35例苯丙酮尿症患者PAH基因第6和7外显子以及其两侧部分内含子序列，进行了突变的筛查和确定。研究吉林地区苯丙酮尿症人群中苯丙氨酸羟化酶（Phenylalanine hydroxylase, PAH）基因突变特征。结果显示: （1） 在70个PAH等位基因中共检测出?9种不同突变基因?，总检出率为44.2%。吉林地区常见的突变是R243Q和EX6－96A＞G，其它较常见突变有IVS7＋2T＞A， R241C， L242F， G247R， G247V， R261X和R176X。（2） 检测出两种多态性位点Q232Q和V245V，推测PAH基因 cDNA序列存在人种差异和地域差异。明确了吉林地区PAH在第6和第7外显子基因及其两侧部分内含子突变类型与中国其它地区相似，高频率突变位点基因突变比例几乎一致，而其它突变位点的基因突变比例存在明显差异。 　　关键词 苯丙酮尿症； 苯丙氨酸羟化???； 基因突变? 　　1 引 言? 　　苯丙酮尿症（Phenylketonuria, PKU）是由于肝脏苯丙氨酸羟化酶（Phenylalanine hydroxylase, PAH）缺乏或活性减低而导致苯丙氨酸代谢障碍的一种常染色体隐性遗传性疾病。目前世界范围内已经报道的突变种类有564种（http://www.pahdb.mcgill.ca/），我国国内报道的突变种类也有100余种??[1,2]?。中国人群中PKU的发病率为1/11000??[3]?，在吉林地区的发病率较高，约为1/3885??[4]?。本研究选取了中国PKU人群中在PAH上有较高突变频率第6和7外显子及其两侧部分内含子为研究对象，利用聚合酶链反应?单链构象多态性分析及基因测序的方法研究吉林地区PAH基因突变分布特征。 　　2 实验部分? 　　2.1 样品采集 ? 　　采集来自吉林省妇幼保健院和长春市妇保所新生儿筛查中心确诊的35例PKU患者的样品，样品为新生儿筛查时所用的干燥滤纸血斑。所有患者血苯丙氨酸浓度＞120 　　?SymbolmA@ mol/L，并应用尿碟呤谱分析、四氢生物碟呤负荷实验及血红细胞二氢生物喋啶还原酶活性测定排除四氢生物喋呤缺乏症。? 　　2.2 分析方法? 　　2.2.1 基因组DNA提取 取每例患儿的干滤纸血斑3片（直径为3.2 mm），使用Omega公司生产的?E.Z.N.A. ?法医学DNA提取试剂盒提取每个患者的基因组DNA，提取后置于－20 ℃保存。? 　　2.2.2 PCR反应 引物参考文献[5]设计合成，序列分别为：? 　　PCR反应在ABI GeneAmp 2700型扩增仪上完成。反应总体积20 　　?SymbolmA@ L，其中含 1.2 U Taq DNA聚合酶和1×反应缓冲液，0.5 pmol/L上下游引物等。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，?55 ℃复性45 s?，72 ℃延伸60 s，共35个循环，72 ℃延伸10 min。PCR产物用2%琼脂糖检测。 　　2.2.3 单链构象多态性（Single strand conformation polymorphism, SSCP）分析 　　? 　　取5 　　?SymbolmA@ L PCR产物与10 　　?SymbolmA@ L的变性缓冲液（含0.25 g/L溴酚蓝，0.25 g/L二甲苯青FF，98%去离子甲酰胺）混匀，100 ℃变性10 min，迅速取出置于冰浴中，上样于10%和8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳?3～6 h?，电泳条件为15～20 ℃，恒流30 mA或恒电压400 V。电泳结束后进行常规银染，分析并记录单链DNA带型。? 　　2.2.4 序列测定 采用 PCR产物直接测序的方法，样品纯化及序列分析由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，应用 ABI 3730XL全自动DNA测序仪通过双向测序序列分析确定突变类型。? 　　 　　? ??分 析 化 学??第39卷? 　　?第12期??王春艳等: 多态性及基因测序分析方法研究苯丙酮尿症患者的基因突变?? ? 　　 　　3 结果与讨论? 　　3.1 PAH基因Exon 6和Exon 7突变分析 　　? 　　在70个PAH等位基因中，共检测出9种不同的突变基因，等位基因检出率为44.2%（31/70），见?表1?。其中错义突变5种、无义突变2种和剪切位点突变2种，突变频率分别为33.8%， 2.8%和8.6%。吉林地区常见的突变基因为R243Q（25.7%）和EX6－96A＞G（5.7%），其它的突变频率相对低一些，分